多种病毒集合检测芯片的研制及其在临床血清标本检测中的初步应用

目的 研制黄热病、西尼罗热、登革热、基孔肯雅热、埃博拉出血热、马尔堡出血热、拉沙热等多种病毒性传染病集合检测基因芯片,并建立一种适用于直接检测核酸含量较低临床血清标本的新型芯片靶基因扩增标记方法.方法 设计并筛选出上述病毒70mer寡核苷酸特异探针各20条,打印于同一基因芯片上；以phi29 DNA聚合酶结合带标签序列的随机引物进行临床标本中病毒全基因组扩增,再以Cy3荧光染料标记的标签序列引物进行PCR随机扩增标记,标记产物用多种病毒芯片进行杂交检测.结果 检测1～4型登革热、基孔肯雅热病例临床血清标本,结果显示该方法准确、特异、敏感；检测西尼罗热、黄热病、埃博拉出血热、马尔堡出血热、拉沙热等病毒核酸的模拟血清标本,同样得到特异的阳性杂交信号,与预期结果一致.结论 本研究建立的多种病毒集合检测基因芯片及其靶基因扩增标记方法,可直接应用于血清标本中上述病毒核酸的检测.     

乙型脑炎病毒膜蛋白B区多肽抗原的表达、纯化及血清学评价

目的在原核表达系统中对乙型脑炎病毒包膜糖蛋白(E蛋白)的B区多肽抗原进行高效表达、纯化及血清学评价。方法利用PCR技术从乙脑减毒活疫苗中扩增编码B区的DNA片段,酶切消化后连接到表达载体pET22b上,用此连接产物转化大肠埃希菌BL21(DE3)并表达B区多肽抗原,表达产物经液相层析纯化;用乙脑病人血清对纯化后的B区多肽抗原进行评价。结果重组质粒pET22b-JEB经双酶切,其插入的外源基因片段为372 bp,与预期DNA片段大小一致。将纯化前与纯化后的蛋白作SDS-PAGE电泳,均可见一条约16kD的外源基因蛋白带,与计算的相对分子质量相符。经WB和ELISA血清学评价,表明重组B区多肽抗原具有较高的灵敏性及特异性。结论成功构建了表达载体pET22b-JEB,在原核系统中表达的B区多肽抗原具有良好的血清学检测价值。     

埃博拉出血热及埃博拉病毒研究现状

目前西非地区正在流行的埃博拉出血热(EHF)由毒力最强的扎伊尔型(EBOV-Z)所致,为40年来最严重的暴发,殃及几内亚、利比里亚、塞拉利昂和尼日利亚西非四国。对于几内亚EBOV-Z毒株来源,目前存在有两种观点,即该病毒为几内亚地区长期潜伏或者由中非输入。非洲地区的水果蝙蝠为最可疑的远距离传播媒介。西非EHF疫情的诱发和扩散受生态环境因素和社会经济因素的影响。埃博拉病毒(EBOV)在近半个世纪频繁出现,可能由于进化过程中突破了基因遗传变异的瓶颈。本文介绍了目前西非EBOV流行情况、病毒来源、宿主和进化等方面的研究进展。     

2009－2012年广东口岸输入性流感疫情监测结果分析

目的对2009—2012年广东口岸输入性流感病例的流行病学特征进行分析,为出入境口岸流感的监测及其防控工作提供依据。方法采集广东25个口岸有发热症状的入境人员的鼻咽拭子,采用实时荧光RT-PCR法对样本进行流感病毒的检测及分型．通过Excel、SPSS18．0对不同型别的流感阳性病例的流行情况进行统计分析。结果2009—2012年广东口岸共发现5723名发热病例,其中985例为输入性流感病例,检出率为17．21％。共呈现5个流行高峰,分别为2009年6—8月,以季节性甲型流感为主;2009年10-12月,以甲型H1N1流感（2009）为主;2010年7-9月,以季节性甲型流感为主;2010年12月-2011年2月,以甲型H1N1流感（2009）为主;2011年12月-2012年2月,以季节性乙型流感为主。甲型H1N1流感（2009）在19岁以下人群检出率较高,季节性甲型流感以50岁以上人群检出率最高,季节性乙型流感则以19岁以下及50岁以上人群检出率较高。结论2009年5月至2012年2月期间,广东口岸入境流感病例中同时有甲型H1N1流感（2009）、季节性甲型流感以及季节性乙型流感的流行,并呈现相互交替的流行特征。不同流感类型在各年龄层分布不同．与性别无关。     

实时荧光RT-PCR技术在黄热病快速检测中的应用

[目的]建立黄热病病毒的实时荧光RT-PCR检测方法并用于口岸黄热病的快速检测. [方法]体外转录黄热病病毒5-UTR的部分序列核酸作为阳性对照模板,设计实时荧光RT-PCR不同的反应程序和引物/探针浓度的组合,摸索最佳反应体系条件并用于黄热病疫苗和入境发热患者标本的检测.[结果]建立的黄热病病毒的实时荧光RT-PCR检测方法最佳反应体系为:2xRT-PCR缓冲液10 μl,正向引物5UTR-FP终浓度750 nM,反向引物5UTR-RP终浓度750 nM,探针5UTR-Probe终浓度500 nM,25xRT-PCR Enzyme Mix 0.8μl,RNA 5μl,用DEPC H2O补足到反应总体积20μl;Roche lightcycler仪器适用的扩增程序为:45℃10 min,95℃10 min;95℃5 s,56℃10 s(single),72℃15 s,45次循环.该方法最低检测限约为20copies病毒/反应,与登革病毒、西尼罗病毒、日本脑炎病毒、基孔肯雅病毒等蚊媒病毒无交叉反应.应用该方法对黄热病疫苗、媒介蚊虫和入境发热患者的血清标本进行检测,结果为黄热病疫苗核酸阳性,其他标本为阴性.[结论]该实时荧光RT-PER方法灵敏度高,特异性强,适用于黄热病病毒的快速检验,防止该病在国境口岸的传入.     

中国云浮口岸蚊媒病毒的首次调查

目的 掌握云浮国境口岸蚊类携带重要蚊媒病毒的现状,探讨提高口岸蚊媒病毒检测有效性的方法,为预防和控制口岸蚊媒传染病的发生提供科学依据。方法 于2011年5月~11月在云浮口岸捕捉活蚊,对蚊标本研磨液提取核酸后应用多重实时荧光RT-PCR技术快速筛查蚊类携带的登革热病毒、日本脑炎(乙脑)病毒、基孔肯雅病毒、西尼罗热病毒和黄热病毒。对实时荧光RT-PCR检测核酸阳性的标本进行PCR扩增和序列分析。结果 在云浮共采集39 254只蚊虫,鉴定后分为460组。经实时荧光RT-PCR检测,14组蚊虫乙脑病毒核酸阳性,其余病毒(登革热病毒、乙脑病毒、基孔肯雅病毒、西尼罗热病毒和黄热病毒)均为阴性。PCR扩增和序列分析显示云浮乙脑病毒属于基因Ⅰ型。所捕获的三带喙库蚊的最小感染率为0.937‰比中华按蚊的0.385‰稍高。结论 本研究首次在云浮口岸进行大规模系统的蚊媒病毒调查,云浮口岸的蚊虫很可能没有携带登革热病毒、基孔肯雅病毒、西尼罗热病毒和黄热病毒,但有少数蚊虫携带乙脑病毒。此次调查检出的基因Ⅰ型乙脑病毒是广东省内的首次报道,为今后蚊媒病毒的媒介监测检测工作提供了有效方法。虽然蚊虫最小感染率的差别没有统计学意义,但是蚊媒病毒病的暴发和流行风险仍然存在。     

应用含内参的多重实时荧光RT-PCR方法快速检测登革病毒和基孔肯雅病毒

目的 建立一种登革病毒、基孔肯雅病毒并含人类基因内参检测的多重实时荧光RT-PCR方法,能在同一反应管内同时检测目前发现的所有来源的登革病毒或基孔肯雅病毒。方法 针对登革病毒3′端非编码区和基孔肯雅病毒结构蛋白E2-6K-E1区以及人体各类组织细胞中均能稳定表达的RNAse P基因,设计了3套特异性引物和探针,建立了1套能同时检测登革病毒、基孔肯雅病毒及含有人类基因检测内参的多重实时荧光RT-PCR方法,对其灵敏性和特异性进行了验证,并对临床发热病人标本进行了应用评估。结果 该方法对检测体外转录合成的登革病毒和基孔肯雅病毒RNA的灵敏性可达最低每个反应10～100拷贝,对检测登革1型病毒和基孔肯雅病毒的灵敏性分别可达最低每个反应0.1 TCID₅₀/mL和1 TCID₅₀/mL。用20株登革病毒、4株基孔肯雅病毒和日本脑炎病毒、西尼罗病毒、黄热病毒、盖塔病毒、辛德毕斯病毒各1株进行检测,方法的特异性均为100%。方法应用于189份发热病人血清标本检测,可准确地鉴定出其中登革病毒或基孔肯雅病毒核酸阳性的标本,且所有血清标本均能被内参引物和探针有效地扩增和杂交。结论 本研究建立了一种高灵敏性、高特异性且含人类基因内参检测的登革病毒和基孔肯雅病毒多重实时荧光RT-PCR检测方法,可作为登革热或基孔肯雅热病人早期快速鉴别诊断的有效工具,也可用于蚊媒携带登革病毒或基孔肯雅病毒的高通量快速筛查。     

广东省2003-2004年SARS的流行与控制

目的分析广东省2003-2004年SARS病例特征、流行因素及控制措施,进一步完善该病预防控制策略和措施。方法用描述流行病学方法对2003-2004年广东省新发SARS病例流行病学及相关因素进行描述和分析。结果2003年8月-2004年6月,广东省共发生4例社区获得性实验室诊断的SARS病例,均未发现有同类病人接触史,也未出现续发病人,其中1例可能因接触果子狸感染,另两例发病前存在接触果子狸的可能,1例感染来源不详。与3例SARS病例相关的两处餐厅从业人员SARSCoV-IgG抗体阳性率6.3%(8/128),从经营果子狸的TDL酒店果子狸笼、厨房RT-PCR检测到SARS基因。野生动物从业人员SARSCoV-IgG抗体阳性率3.3%(46/1390),高于非野生动物从业人员(0/452)。发病后平均3d就诊,平均在发病后5.8d(4~7d)就被隔离,有3例是在发病后5~6d,有1例是在其发病后12d便对其密切接触者实施医学观察等现场控制。采取在广东省范围内禁食、杀灭果子狸等野生动物措施后,没有再出现SARS病例。结论早发现、早报告、早隔离,做好SARS早期预警监测工作是预防控制SARS疫情蔓延的关键,管理可疑的染疫动物是预防再发的有效措施。     

广东省1990～2000年登革热流行病学分析

目的 明确广东省登革热流行因素。探讨预防控制对策。方法 调查分析1990-2000年登革热病例的分布特征和流行因素，测定登革Ⅰ型病毒地方分离株E/NS1基因片段核苷酸序列。结果 1990-2000年间，广东省共报告登革热病例9747例，死亡3例。年发病率在0/10万-9.75/10万之间，平均为1.27/10万。流行多呈爆发，疫情涉及13个市（占全省21个市的61.9%)。主要集中在广州，潮州，肇庆和佛山市，呈现高度集中而相对分散特点，敏月均有登革热病例报告，其中1-6月份为散发输入病例，7-12月份为流行期，男性：女性为1.04:1，所有年龄组均易感，四个型别的登革病毒均发生过流行，同一地区不同年份可流行不同型别病毒，同一年份不同地区也可流行不同型别病毒，广东省12株登革Ⅰ型病毒地方分离株E/NS1基因片段核苷酸序列，显示广东省登革Ⅰ型代表毒株可分为两个基因亚型。临床表现以典型登革热为主，广东省存在有利于登革热流行的自然因素和社会因素。结论 广东省登革热疫情同国外登革热流行程度相关联。流行呈输入性流行的特征，至今仍无证据表明已成为地方性疾病。     

疟疾的实时荧光PCR快速检测方法

目的:建立疟疾的实时荧光PCR检测方法并用于疟疾的快速检测。方法:设计了疟原虫通用型实时荧光PCR检测的引物和探针,建立了疟疾的实时荧光PCR检测方法。对40份疟疾镜检阳性样本和20份镜检阴性样本进行实时荧光PCR检测,并和巢式PCR方法检测结果进行了比较。结果:疟疾实时荧光PCR检测速度快,20分钟即可完成。40份镜检阳性样本的荧光PCR检测均为阳性,2份样本的巢式PCR结果为阴性;20份镜检阴性样本中有3份样本为实时荧光PCR阳性,其余17份样本为实时荧光PCR阴性,与疟疾巢式PCR检测结果相同。结论:该实时荧光PCR方法检测速度快,特异性强,准确性高,阳性率高,不易漏检,适用于疟疾的快速检验,这对防止该病在国境口岸的传入提供了技术依据。