人脂肪间充质干细胞的分离培养及其遗传稳定性

背景:研究发现脂肪间充质干细胞核型具有不稳定性,且干细胞移植后长期安全评价等问题尚未从根本上得到解决.目的:观察体外分离培养的人脂肪间充质干细胞传代培养的遗传稳定性.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-03/11在解放军兰州军区兰州总医院骨科研究中心完成.材料:成人腹部大网膜脂肪组织来源于单纯性阑尾炎患者,由解放军兰州军区兰州总医院普通外科提供.方法:胶原酶消化法体外分离培养人脂肪间充质干细胞,加入含体积分数为10%胎牛血清的HG-DMEM培养基吹打细胞沉淀,过滤后于37℃、体积分数为5%的CO2饱和湿度条件下培养,待细胞生长至70%～80%融合时消化传代.分别取第3,25,30代脂肪间充质干细胞进行相关指标检测.主要观察指标:脂肪间充质干细胞表面标志表达、细胞增殖、核型分析、超微结构电镜观察、恶性肿瘤特异性生长因子的表达.结果:第3代脂肪间充质干细胞CD13,CD44,CD59均呈阳性表达,而造血干细胞表面标志CD34及成纤维细胞表面标志HLA-DR均呈阴性表达:染色体的形态、结构和数目均未见异常,呈二倍体结构;镜下可见完整的高尔基复合体,数量较多的粗面内质网,部分糖元颗粒分布在胞浆中.第25代脂肪间充质干细胞分裂增殖作用强于第3代脂肪间充质干细胞;多条染色体出现断裂畸变,并且染色体数目出现异常,呈亚二倍体或超二倍体核型;核仁增大,异染色质及线粒体数量增多,内质网数量少,细胞较为幼稚.第3,25,30代脂肪间充质干细胞恶性肿瘤特异性生长因子的表达吸光度值无明显差异(P>0.05).结论:分离获得的人脂肪间充质干细胞长期体外培养具有遗传不稳定性,有向肿瘤细胞突变的倾向.     

内皮祖细胞增殖、迁移和黏附能力与端粒酶活性的关系

目的 观察体外培养外周血内皮祖细胞(EPCs)增殖、迁移和黏附能力与EPCs端粒酶活性之间的关系.方法 密度梯度离心法获取人外周血单个核细胞(MNCs),接种至明胶包被的培养板上,培养7 d后进行细胞免疫组化鉴定EPCs,采用MTT比色法、Transwell小室和黏附能力测定实验,观察EPCs的增殖、迁移和黏附能力.TRAP-PCR银染法检测EPCs端粒酶活性.结果 从人外周血能成功分离EPCs细胞.从冠心病患者分离的EPCs增殖、迁移、黏附能力较非冠心病患者下降.冠心病患者EPCs端粒酶活性较非冠心病患者低.结论 冠心病患者EPCs功能显著减弱.可能与EPCs端粒酶活性降低有关.     

老年变异型心绞痛2例

1临床资料 患者1,男性,72岁,因“间断心前区疼痛1年,加重12h”,于2010年6月26日以“急性冠脉综合征”入院。患者无明显诱因反复出现心前区疼痛1年,每次持续3min左右,含服“硝酸甘油”后缓解,多于凌晨4：00～5：00时发作。入院前12h反复发作10余次,含服“硝酸甘油”约3min缓解。既往有高血压病史2年,血压控制尚可。吸烟40余年,平均20支／d。无糖尿病、冠心病家族史。查体：     

谷氨酰胺与缬沙坦对大鼠心房纤维化及缝隙连接蛋白43重构的影响

目的 研究谷氨酰胺(Gln)与缬沙坦对大鼠心房纤维化及缝隙连接蛋白43(Cx43)重构的影响及其可能的作用机制.方法 将SD雄性大鼠(160±20)9 32只随机等分为对照组(A组)、盐酸异丙肾上腺素(ISO)(5 mg·kg-1·d-1)(B组)、ISO(5 mg·kg-1·d-1)+丙氨酰谷酰胺注射液(Ala-Gln)(0.75 mg·kg-1·d-1)(C组)和ISO(5 mg·kg-1·d-1)+缬沙坦(30 mg·kg-1·d-1)(D组).各组1次/d给予相关试剂,ISO连续给药7d,而后C、D两组大鼠继续给予相关试剂至28 d后处死.心肌组织中血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)含量采用放免法检测;通过H-E染色观察心肌纤维化情况;Masson染色计算胶原容积分数(CVF)并作为心肌纤维化程度的量化指标;免疫组化SP法半定量测定心肌组织中热休克蛋白70(HSP70)、磷酸化c-Jun氨基末端激酶1/2/3(p-JNK1/2/3)、c-Jun及Cx43蛋白的表达.结果 Ang Ⅱ在B、C、D组中含量较A组显著升高且差异有统计学意义(P＜0.01);B组与A、C、D组相比出现明显的心房纤维化(P＜0.01)且心肌组织中p-JNK1/2/3和c-Jun的含量较高,差异有统计学意义(P＜0.01),C、D组与A组相比心房纤维化程度及心肌组织中p-JNK1/2/3和c-Jun的含量差异无统计学意义(P＞0.05);与其他各组相比,C组中HSP70的含量明显升高,且差异有统计学意义(P＜0.01),A、B、D组中HSP70的含量相互间差异均无统计学意义(P＞0.05);B组中Cx43含量较A组减少(P＜0.01)且分布无规律性,侧面化分布相对增多.而C、D组中Cx43含量与A组比较差异无统计学意义(P＞0.05)且部分呈线性分布于心肌细胞闰盘处;C、D两组中Cx43含量比较差异均无统计学意义(P＞0.05).结论 谷氨酰胺与缬沙坦均可减轻Ang Ⅱ诱发的大鼠心房纤维化及Cx43重构,其机制可能与降低p-JNK1/2/3和c-Jun的表达,抑制JNK信号通路的不同位点有关,在改善大鼠心房纤维化程度和Cx43重构方面起到类似的作用.     

培养基血清浓度对5-氮胞苷诱导脂肪间充质干细胞向心肌样细胞诱导分化的影响

目的 观察脂肪间充质干细胞（ADMSCs）向心肌样细胞诱导分化的适宜培养基血清浓度。方法采用Ⅰ型胶原酶消化法自成人脂肪组织分离ADMSCs进行培养。对第3代细胞以10μmol／L的5-氮胞苷（5-aza）诱导作用24h,用含10％、5％胎牛血清的完全培养基继续培养,镜下观察细胞形态学变化,采用免疫细胞化学染色鉴定心肌特异性肌钙蛋白Ⅰ（cTnⅠ）,计算心肌细胞转化率,采用RT—PCR方法检测NKX2．5、GATA4及cTnⅠ基因表达。结果5-aza诱导ADMSCs后7d细胞形态及排列开始发生变化,4周后可见极个别细胞出现细微搏动,10％、5％胎牛血清培养下心肌样细胞转化率分别为31．5％±4．2％、32．8％±5．0％,P=0．72;RT-PCR产物条带见NKX2．5、GATA4及cTnⅠ基因表达。结论ADMSCs在-aza诱导后于低浓度血清培养基中培养效果更好。     

右美托咪定对心肌收缩蛋白表达的影响

目的 研究右美托咪定(DEX)对心肌细胞收缩相关蛋白表达的影响及其分子机制。 方法 在50 ml/L浓度氧环境下培养H9C2细胞,建立心肌低氧损伤模型。实验分为对照组、低氧组、低氧+DEX (0.01 μmol/ml、1 μmol/ml、100 μmol/ml)组。除对照组培养在正常细胞环境中外,其余四组培养在低氧环境下,且其中三组按要求添加相应浓度的DEX。细胞存活率和细胞凋亡水平分别采用MTT法和流式细胞仪进行检测,采用ELISA试剂盒检测细胞培养液中心肌酶谱蛋白cTnI、LDH和CK-MB的漏出量,Western blot法检测H9C2细胞中titin、β-MHC、PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt蛋白表达。 结果 低氧条件成功诱导心肌细胞缺氧损伤。低氧组细胞较对照组存活率低、凋亡增加、细胞培养液中cTnI、LDH和CK-MB蛋白水平增加;低氧+ DEX (0.01 μmol/ml、1 μmol/ml、100 μmol/ml)组较低氧组,细胞存活率增加、凋亡减少,cTnI、LDH和CK-MB蛋白水平降低,p-PI3K和p-Akt蛋白表达增加,β-MHC和titin蛋白表达降低,且随着DEX剂量增加,变化更显著。 结论 在低氧损伤心肌细胞中,DEX能抑制收缩相关蛋白表达,可能与PI3K/Akt信号通路有关,是否与激活PI3K/Akt信号通络相关,还有待进一步研究。     

人脂肪间充质干细胞的分离培养及其遗传稳定性

背景：研究发现脂肪间充质干细胞核型具有不稳定性，且干细胞移植后长期安全评价等问题尚未从根本上得到解决。 目的：观察体外分离培养的人脂肪间充质干细胞传代培养的遗传稳定性。 设计、时间及地点：细胞学体外观察，于2008-03/11在解放军兰州军区兰州总医院骨科研究中心完成。 材料：成人腹部大网膜脂肪组织来源于单纯性阑尾炎患者，由解放军兰州军区兰州总医院普通外科提供。 方法：胶原酶消化法体外分离培养人脂肪间充质干细胞，加入含体积分数为10%胎牛血清的HG-DMEM培养基吹打细胞沉淀，过滤后于37 ℃、体积分数为5%的CO2饱和湿度条件下培养，待细胞生长至70%~80%融合时消化传代。分别取第3，25，30代脂肪间充质干细胞进行相关指标检测。 主要观察指标：脂肪间充质干细胞表面标志表达、细胞增殖、核型分析、超微结构电镜观察、恶性肿瘤特异性生长因子的表达。 结果：第3代脂肪间充质干细胞CD13，CD44，CD59均呈阳性表达，而造血干细胞表面标志CD34及成纤维细胞表面标志HLA-DR均呈阴性表达；染色体的形态、结构和数目均未见异常，呈二倍体结构；镜下可见完整的高尔基复合体，数量较多的粗面内质网，部分糖元颗粒分布在胞浆中。第25代脂肪间充质干细胞分裂增殖作用强于第3代脂肪间充质干细胞；多条染色体出现断裂畸变，并且染色体数目出现异常，呈亚二倍体或超二倍体核型；核仁增大，异染色质及线粒体数量增多，内质网数量少，细胞较为幼稚。第3，25，30代脂肪间充质干细胞恶性肿瘤特异性生长因子的表达吸光度值无明显差异(P > 0.05)。 结论：分离获得的人脂肪间充质干细胞长期体外培养具有遗传不稳定性，有向肿瘤细胞突变的倾向。     

5-氮胞苷对脂肪间充质干细胞向心肌样细胞诱导分化的影响

目的：观察5-氮胞苷（5-aza）对脂肪间充质干细胞（ADMSCs）向心肌样细胞诱导分化的影响。方法：对第3代细胞以10μmol／L 5-aza诱导作用24h后,用含体积分数5％胎牛血清的完全培养基继续培养,镜下观察细胞形态学变化。RT—PCR检测NKX2．5、GATA4及cTnI基因mRNA表达,免疫组化法检测cTnI蛋白表达。结果：5-aza作用7d后ADMSCs形态及排列开始发生变化,RT—PCR产物条带见NKX2．5、cATA4基因的表达。4周后见极个别细胞出现细微搏动,免疫细胞化学显示cTnI阳性,RT—PCR产物条带见cTnI基因表达。结论：5-aza可以诱导ADMSCs向自发搏动的心肌样细胞分化。     

氯吡格雷联合替罗非班用于STEMI患者PCI术后的抗血小板治疗及对血清炎症因子的影响

目的分析氯吡格雷联合替罗非班用于急性ST段抬高型心肌梗死(STEMI)患者经皮冠状动脉介入(PCI)术后的抗血小板治疗及对血清炎症因子的影响。方法回顾性分析2016年5月至2017年5月在西安市国际医学中心医院心内科治疗的127例STEMI患者资料,将其中采用氯吡格雷抗凝的患者63例作为对照组,采用氯吡格雷联合替罗非班抗凝的64例作为观察组,所有患者入院后均给予常规基础治疗,对照组在上述治疗基础上术前给予氯吡格雷300mg,口服,术后继续维持治疗;观察组在对照组基础上给予术中静脉推注替罗非班,维持用药36h,术后继续口服氯吡格雷维持。观察两组患者的抗血小板治疗效果及对血清炎症因子的影响。结果两组患者PCI术前心肌梗死溶栓试验(TIMI)血流分级经比较差异无统计学意义(P>0.05);观察组患者PCI术后TIMI血流分级明显优于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。两组患者PCI术前血小板黏附率及血小板聚集率差异无统计学意义(P>0.05);两组患者PCI术后血小板黏附率及血小板聚集率与术前比较均明显降低(P<0.05),且观察组明显优于对照组(P<0.05)。两组患者治疗后血清中C反应蛋白(CRP)、白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平均较治疗前降低,差异有统计学意义(P<0.05),且观察组降低更加明显(P<0.05);所有患者出院1个月后均定期门诊随访行心脏彩超检查,观察组左室射血分数(LVEF)、左室舒张末期内径(LVEDD)与对照组比较均明显改善,差异有统计学意义(P<0.05);观察组住院期间及出院后1个月内心脑血管不良反应事件发生率明显低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论氯吡格雷联合替罗非班术后可以明显抑制血小板功能,改善心肌再灌注和心功能,减少严重心脑血管不良反应事件的发生,值得推广应用。     

法舒地尔对老年慢性充血性心衰患者心功能及脑钠肽的影响

目的探讨Rho激酶(ROCK)抑制剂法舒地尔对老年慢性充血性心力衰竭(CHF)患者心功能及脑钠肽(BNP)水平的影响。方法将120例NYHA心功能Ⅲ～Ⅳ级的老年患者分为两组:(1)对照组60例给予常规抗心衰治疗(强心剂、利尿剂、β-受体阻滞剂及ACEI/ARB等);(2)治疗组60例在对照组常规抗心衰治疗基础上加用法舒地尔静脉滴注,两组患者均治疗14 d,观察治疗前、后6 min步行距离、左室射血分数(LVEF)及血浆BNP水平的变化。结果治疗14 d后,同常规抗心衰治疗组相比,加用法舒地尔组患者临床有效率、6min步行距离及LVEF明显提高,BNP显著降低(P<0.05)。结论法舒地尔结合常规抗心衰治疗能够明显改善老年CHF患者的临床症状及心功能指标,疗效优于单纯常规药物治疗。