日本血吸虫热休克因子基因结构特征及其可变剪切亚型分析研究

目的克隆、鉴定日本血吸虫热休克因子(Sj-hsf),并分析其基因结构特征和可变剪切亚型。方法以日本血吸虫尾蚴感染新西兰白兔,42 d后剖杀,以灌注法收集雌虫、雄虫及感染兔肝脏,以Trizol法提取总RNA。以RT-PCR扩增日本血吸虫雌虫、雄虫、虫卵总RNA,获得Sj-hsf开放阅读框(ORF)全长片段和Sj-hsf可变剪切区域片段,并进行克隆、酶切及测序鉴定。用DNAMAN 8.0、Inter Pro、Mega 6结合日本血吸虫和曼氏血吸虫基因组数据库以及Gen Bank等网络分析平台,分析Sj-hsf的基因结构特征、功能结构域、可变剪切模式以及不同物种间HSF序列的同源性和进化树。结果自雌虫、雄虫、虫卵扩增获得靶片段,并克隆获得阳性重组质粒,其中含Sj-hsf ORF的p BSj HSFf-F、p BSj HSFf-M、p BSj HSFf-E以及含可变剪切片段的p BSj HSFs-F、p BSj HSFs-M、p BSj HSFs-E,酶切及测序鉴定正确。序列分析显示Sj-hsf具有3种剪切亚型:Sj-hsf-isoform1(2 050 bp)、Sj-hsf-isoform2(2 086 bp)、Sj-hsf-isoform3(2 111 bp),Gen Bank登录号分别为KU954546、KX119143、KX119144,均位于日本血吸虫基因组SJC-S000780,有8个外显子,在雌虫、雄虫和虫卵阶段3种亚型均存在,以Sj-hsf-isoform1表达量高。Sj-HSF-isoform1(671 aa)、Sj-HSF-isoform2(683 aa)具有HSF特征性DBD(DNA Binding Domain)、HR-A/B和HR-C结构域,Sj-HSF-isoform3(282 aa)提前终止,无HR-C结构域。进化树分析表明Sj-HSF三种剪切亚型隶属HSF1,与曼氏血吸虫HSF近源。结论日本血吸虫雌虫、雄虫、虫卵阶段均存在3种剪切亚型的HSF,以Sj-HSF-isoform1表达量高。本研究为进一步阐明Sj-HSF调控Sj-HSPs等应激防御体系的分子机制奠定了基础。     

TLR4在大鼠坐骨神经损伤后Wallerian溃变过程中的体内作用研究*

目的：研究TLR4（Toll-like receptor 4）在大鼠坐骨神经损伤后,Wallerian溃变过程中的作用,为周围神经损伤修复与再生的研究提供实验依据。方法：制备大鼠损伤坐骨神经模型;利用修饰过的TLR4基因过表达质粒导入大鼠损伤坐骨神经远端组织;通过实时荧光定量PCR和Western Blot的方法分析损伤7d、14d后基因和蛋白的表达,以及相关信号通路的变化。结果：在大鼠坐骨神经损伤7d、14d后,实时荧光定量PCR显示,远端TLR4的过表达引起Bax、Bcl-2、NF2、NT3、PKCα等基因的表达变化,Western Blot显示TLR4过表达后,p-AKT/AKT、p-c-Jun/c-Jun和p-ERK/ERK等蛋白的表达发生显著性差异。结论：TLR4在大鼠坐骨神经损伤后,Wallerian溃变过程中可能发挥了重要的调控作用。     

日本血吸虫主要虫卵抗原Sjp40在感染新西兰白兔肝脏中的表达与免疫定位

目的观察Sjp40在感染新西兰白兔肝脏沉积虫卵及其肉芽肿病变形成中的表达情况,并进行免疫定位。方法日本血吸
虫尾蚴感染新西兰白兔,收集未感染组、29 dpi组和45 dpi组肝脏,Trizol法提取各组肝脏总RNA,以日本血吸虫甘油醛-3-磷酸
脱氢酶（GAPDH）为内参,Taqman探针qRT-PCR检测Sjp40 mRNA的表达;提取各组肝脏总蛋白,以硫酸铵盐析法和Protein G
免疫亲和柱层析法纯化的抗Sjp40-McAb 9G7和抗弓形虫tSAG1-McAb Y3A8（对照抗体）,western blot检测Sjp40蛋白的表达;
制备肝脏石蜡切片,HE染色观察肝脏虫卵肉芽肿的形成与发展,进一步以免疫荧光技术进行Sjp40在肝脏沉积虫卵及其肉芽肿
组织中的定位。结果日本血吸虫感染兔呈急性肝肉芽肿病变期的45 dpi肝脏沉积虫卵中Sjp40 mRNA水平显著高于29 dpi 尚
未形成虫卵肉芽肿结节的肝脏沉积的未成熟虫卵（P<0.05）,westernb blot 证实了Sjp40 蛋白在29 dpi 和45 dpi 兔肝脏中的表
达。免疫荧光显示：Sjp40在29 dpi兔肝脏中定位于未成熟虫卵内,而45 dpi可见感染兔肝脏中沉积大量成簇内含毛蚴的成熟虫
卵及其周围肉芽肿组织均有明显荧光。结论Sjp40在日本血吸虫感染兔肝脏沉积虫卵中的转录水平随虫卵发育成熟而显著增
加,在感染兔急性肉芽肿病变期（45dpi）呈现由虫卵向其周围肉芽肿组织扩散现象,提示该分子在血吸虫肉芽肿形成与发展过
程中具有重要作用。