日本血吸虫热休克因子基因结构特征及其可变剪切亚型分析研究

目的克隆、鉴定日本血吸虫热休克因子(Sj-hsf),并分析其基因结构特征和可变剪切亚型。方法以日本血吸虫尾蚴感染新西兰白兔,42 d后剖杀,以灌注法收集雌虫、雄虫及感染兔肝脏,以Trizol法提取总RNA。以RT-PCR扩增日本血吸虫雌虫、雄虫、虫卵总RNA,获得Sj-hsf开放阅读框(ORF)全长片段和Sj-hsf可变剪切区域片段,并进行克隆、酶切及测序鉴定。用DNAMAN 8.0、Inter Pro、Mega 6结合日本血吸虫和曼氏血吸虫基因组数据库以及Gen Bank等网络分析平台,分析Sj-hsf的基因结构特征、功能结构域、可变剪切模式以及不同物种间HSF序列的同源性和进化树。结果自雌虫、雄虫、虫卵扩增获得靶片段,并克隆获得阳性重组质粒,其中含Sj-hsf ORF的p BSj HSFf-F、p BSj HSFf-M、p BSj HSFf-E以及含可变剪切片段的p BSj HSFs-F、p BSj HSFs-M、p BSj HSFs-E,酶切及测序鉴定正确。序列分析显示Sj-hsf具有3种剪切亚型:Sj-hsf-isoform1(2 050 bp)、Sj-hsf-isoform2(2 086 bp)、Sj-hsf-isoform3(2 111 bp),Gen Bank登录号分别为KU954546、KX119143、KX119144,均位于日本血吸虫基因组SJC-S000780,有8个外显子,在雌虫、雄虫和虫卵阶段3种亚型均存在,以Sj-hsf-isoform1表达量高。Sj-HSF-isoform1(671 aa)、Sj-HSF-isoform2(683 aa)具有HSF特征性DBD(DNA Binding Domain)、HR-A/B和HR-C结构域,Sj-HSF-isoform3(282 aa)提前终止,无HR-C结构域。进化树分析表明Sj-HSF三种剪切亚型隶属HSF1,与曼氏血吸虫HSF近源。结论日本血吸虫雌虫、雄虫、虫卵阶段均存在3种剪切亚型的HSF,以Sj-HSF-isoform1表达量高。本研究为进一步阐明Sj-HSF调控Sj-HSPs等应激防御体系的分子机制奠定了基础。     

白纹伊蚊同步产卵诱导体系的优化及其卵胚发育观察

为构建白纹伊蚊同步产卵人工诱导体系,并对白纹伊蚊卵胚发育进行观察研究,本文通过对广州白纹伊蚊野生株和实验室传代的佛山株实施同步产卵人工诱导.结果发现使用黑色仿瓷杯作为诱卵容器、未漂白竹浆纸作为诱卵纸的同步产卵诱导效果良好,产卵动态观察结果显示:野生株产卵后第1d产卵量从3.4％提高到51％,前3d合计产卵量从30.2％升至97％,总产卵时长从18d缩短至7d;佛山株产卵后第1d产卵量从40％提高到94％,前3d合计产卵量从84％升至99.7％,总产卵时长从13 d缩短至5d.对白纹伊蚊卵胚发育观察发现,白纹伊蚊卵胚经历了胚盘形成和原肠胚形成、胚带延伸、胚带收缩、背向闭合及卵胚发育结束5个发育阶段,各阶段的发育时间与埃及伊蚊不同.优化了白纹伊蚊同步产卵诱导体系,为白纹伊蚊卵相关研究提供参考.     

疟原虫全虫疫苗长效保护性下降机制初探

目的探讨疟疾红外期全虫疫苗免疫保护性随时间逐渐降低的机制。方法取C57BL/6及BALB/c小鼠,经尾静脉分别接种10 000或50 000约氏疟原虫(P.yoelii)17XNL子孢子,3h后给予氯喹控制红内期感染的发生。一部分小鼠于接种后30、90、180d用10 000同种疟原虫子孢子进行攻击检查保护性;另一部分在相同时间点取血,分离淋巴细胞,进行流式抗体染色,检测免疫保护性及其与肝脏淋巴细胞表型间的相互关系。结果疟原虫全虫抗原免疫后30d两种小鼠均可产生100%的免疫保护;免疫后90d,C57BL/6保护性开始下降,180d时保护性将至40%,而BALB/c小鼠保护性无明显变化。C57BL/6小鼠肝脏CD8~+T_(EM)细胞PD-1的表达在免疫后180d显著上升(t=7.369,P0.01),BALB/c小鼠无明显变化(t=1.368,P0.05)。C57BL/6小鼠肝脏CD8~+T_(EM)细胞PD-1的表达免疫后随时间增加而升高,其中免疫后180d较90d时上升趋势更显著(t=6.175,P0.01)。结论在C57BL/6小鼠,疟原虫红外期全虫疫苗免疫保护性随免疫时间延长逐渐降低与肝脏CD8~+T细胞PD-1表达增高有关。     

miR-106b表达下调介导疟疾红内期疫苗免疫保护性下降

目的探讨miR-106b在疟疾红内期感染后控制疫苗免疫保护性随时间逐渐降低中的作用。方法 C57BL/6小鼠通过尾静脉接种约氏疟原虫P.yoelii 17XNL感染的红细胞,接种小鼠给予氯喹控制红内期感染的发生。接种完成后不同时间点(30 d、90 d、180 d)首先检测小鼠免疫保护性,ELISA检测小鼠血清抗红内期疟原虫抗体滴度,q RT-PCR检测血清miR-106b表达情况。然后,通过流式细胞技术检测脾脏B细胞TACI(transmembrane activator and CAML interactor)表达变化。最后通过体外培养B细胞,加入miR-106b mimic后检测B细胞TACI表达变化。结果免疫后30 d小鼠可产生100%的免疫保护,免疫后90 d小鼠在i RBC攻击后第3天均出现感染,而免疫后180 d小鼠在i RBC攻击后第2天均出现感染。同时,免疫后180 d与30 d相比抗体滴度明显下降(P<0.01),并且小鼠血清中miR-106b的表达也呈现明显的下降趋势。流式细胞分析发现免疫后180 d小鼠脾脏记忆性B细胞(memory B cells,MBCs)表面TACI表达比免疫30 d及90 d小鼠均出现明显下降(P<0.01)。体外培养B细胞加入miR-106b mimic后TACI表达增高。结论疟原虫红内期感染后控制疫苗保护性降低与血清中miR-106b及脾脏MBCs表面TACI表达降低有关,提高miR-106b的浓度可增加MBCs表面TACI的表达。     

龙船花抗炎有效部位探讨及对小鼠胸腺与脾脏指数的影响

目的研究龙船花水与醇提取物及其有效部位的抗炎作用,并探讨其对小鼠胸腺与脾脏指数的影响。方法将小鼠分为空白对照组(等体积蒸馏水)、阳性药组(阿司匹林,0.2 g/kg,脾脏与胸腺指数此组除外)、龙船花水煎液组、龙船花醇提液组(70%乙醇)、水-乙酸乙酯组、水-正丁醇组、醇-乙酸乙酯组、醇-正丁醇组,每组10只,除空白对照组与阳性药组外,其余每组均以2.925 g/kg灌胃给药,每天1次,连续7天。分别采用二甲苯致炎法测定小鼠耳肿胀度与抑制率和角叉菜胶致炎后小鼠第0.5、1、2、3、4、5、6小时的足跖肿胀度与抑制率;末次给药后脱颈椎处理,记录并计算小鼠的胸腺与脾脏指数。考察龙船花水与醇提取物及其有效部位的抗炎作用及对小鼠胸腺与脾脏指数的影响。结果与空白对照组对比,龙船花水与醇提取物及其相应乙酸乙酯与正丁醇有效部位均可显著降低小鼠耳肿胀度与致炎后第1、3、4、6小时的足跖肿胀度(P0.05或P0.01),均可不同程度地抑制小鼠耳肿胀与足跖肿胀;龙船花醇-乙酸乙酯组,水-正丁醇组,醇-正丁醇组均可显著升高小鼠的胸腺指数(P0.05或P0.01);龙船花水-正丁醇组可显著升高脾脏指数(P0.01)。结论龙船花提取物及其相应乙酸乙酯与正丁醇有效部位具有明显的抗炎活性,可显著提高小鼠胸腺指数与脾脏指数的作用。     

日本血吸虫主要虫卵抗原Sjp40在感染新西兰白兔肝脏中的表达与免疫定位

目的观察Sjp40在感染新西兰白兔肝脏沉积虫卵及其肉芽肿病变形成中的表达情况,并进行免疫定位。方法日本血吸
虫尾蚴感染新西兰白兔,收集未感染组、29 dpi组和45 dpi组肝脏,Trizol法提取各组肝脏总RNA,以日本血吸虫甘油醛-3-磷酸
脱氢酶（GAPDH）为内参,Taqman探针qRT-PCR检测Sjp40 mRNA的表达;提取各组肝脏总蛋白,以硫酸铵盐析法和Protein G
免疫亲和柱层析法纯化的抗Sjp40-McAb 9G7和抗弓形虫tSAG1-McAb Y3A8（对照抗体）,western blot检测Sjp40蛋白的表达;
制备肝脏石蜡切片,HE染色观察肝脏虫卵肉芽肿的形成与发展,进一步以免疫荧光技术进行Sjp40在肝脏沉积虫卵及其肉芽肿
组织中的定位。结果日本血吸虫感染兔呈急性肝肉芽肿病变期的45 dpi肝脏沉积虫卵中Sjp40 mRNA水平显著高于29 dpi 尚
未形成虫卵肉芽肿结节的肝脏沉积的未成熟虫卵（P<0.05）,westernb blot 证实了Sjp40 蛋白在29 dpi 和45 dpi 兔肝脏中的表
达。免疫荧光显示：Sjp40在29 dpi兔肝脏中定位于未成熟虫卵内,而45 dpi可见感染兔肝脏中沉积大量成簇内含毛蚴的成熟虫
卵及其周围肉芽肿组织均有明显荧光。结论Sjp40在日本血吸虫感染兔肝脏沉积虫卵中的转录水平随虫卵发育成熟而显著增
加,在感染兔急性肉芽肿病变期（45dpi）呈现由虫卵向其周围肉芽肿组织扩散现象,提示该分子在血吸虫肉芽肿形成与发展过
程中具有重要作用。