日本血吸虫热休克蛋白40 kDa免疫学功能研究

目的探索日本血吸虫热休克蛋白40 k Da(Sj HSP40)免疫学功能。方法采用生物信息学方法分析Sj HSP40蛋白序列同源性,并预测其B细胞及T细胞表位。应用PCR技术扩增全长Sj HSP40基因,将其克隆入原核表达质粒p GEX-6P-1,再转入大肠埃希菌BL21中;以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,再经亲和柱分离纯化获得谷胱甘肽巯基转移酶(GST)-Sj HSP40融合蛋白,分别采用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及Western blotting进行鉴定。以GST-Sj HSP40免疫BALB/c小鼠后,以酶联免疫吸附试验(ELISA)检测小鼠血清中抗Sj HSP40特异性Ig G抗体及其亚型Ig G1、Ig G2a抗体,采用流式检测术观察Sj HSP40对CD4+T细胞亚群分化的影响。结果 Sj HSP40含有7个潜在B细胞表位及多个T细胞表位(CTL表位和Th表位)。成功构建了原核表达重组质粒p GEX-6P-1-Sj HSP40,并通过诱导表达和蛋白纯化获得GST-Sj HSP40融合蛋白。与其他组相比,GST-Sj HSP40免疫小鼠血清中抗Sj HSP40特异性Ig G抗体及其亚型Ig G1和Ig G2a水平均显著升高,但Sj HSP40对CD4+T淋巴细胞分化无显著影响。结论 Sj HSP40可诱导小鼠产生特异性体液免疫应答,但不影响小鼠体内各类Th免疫反应平衡,可作为潜在疫苗候选分子。     

日本血吸虫热休克蛋白70(Sj HSP70)的抗体反应特征及免疫诊断价值

目的制备重组日本血吸虫中国大陆株热休克蛋白[rSj HSP70(Grp78)],检测其抗体反应特征及用于血吸虫病免疫诊断的价值。方法以日本血吸虫中国大陆株成虫mRNA为模板逆转录合成cDNA,采用基因特异性引物,通过PCR技术扩增编码Sj HSP70(Grp78)成熟肽的基因片段,并将该片段插入到表达质粒pET28a(+)中,构建表达质粒HSP70(Grp78)-pET28a。将重组质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达后采用镍亲和层析法制备纯化的可溶性rSj HSP70(Grp78)。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)及Western blot检测rSj HSP70(Grp78)的抗体反应特异性及抗rSj HSP70(Grp78)IgG在血吸虫感染小鼠血清中动态变化,以分析其早期诊断与疗效考核价值,并比较rSj HSP70(Grp78)-ELISA与SEA-ELISA检测血吸虫感染者血清抗体IgG的敏感性与特异性。结果编码Sj SP70(Grp78)成熟肽基因片段克隆成功,并获得纯化的分子质量单位约69ku的重组表达Sj HSP70(Grp78)蛋白。Western blot显示Sj HSP70(Grp78)蛋白能被日本血吸虫感染的小鼠及人血清识别,但不与华支睾吸虫病和卫氏并殖吸虫病患者血清及健康人、鼠血清反应。感染小鼠血清抗Sj HSP70(Grp78)IgG水平与血吸虫感染度呈正相关,并随着感染时间延长呈增强趋势,在感染后16~18周达到峰值,随后开始回调,但始终维持在较高水平。治疗组小鼠经药物治疗后第2周(感染后第8周),体内抗体水平迅速上升并达到高峰,经过短暂下降后再次上升,出现第二个高峰,随后逐渐回调,至治疗16周(感染后第22周),部分小鼠抗体水平已接近阴性阈值。部分个体在血吸虫感染后1周即可检测到血清抗rSj HSP70(Grp78)IgG。分别以rSj HSP70(Grp78)和SEA血吸虫、华支睾吸虫及卫氏并殖吸虫感染者血清及健康人血清,敏感性分别为82.9%和95.7%,特异性分别为94.3%和85.7%,与健康人血清的交叉反应率分别为0和16.67%,与华支睾吸虫感染者血清的交叉反应率分别为5.7%和14.29%;与卫氏并殖吸虫感染者血清的交叉反应率分别为5%和65%。结论 Sj HSP70(Grp78)具有高度的抗原特异性,以此为抗原采用ELISA检测抗Sj HSP70(Grp78)IgG具有日本血吸虫病辅助诊断价值,并具有一定的早期诊断与疗效考核潜能。     

寄生虫热休克蛋白及其在血吸虫方面的研究进展

本文以ＨＳＰ７０和ＨＳＰ９０为例，简述了热休克蛋白的功能及基因表达调控，寄生虫热休克蛋白与参寄生虫分化并增强其毒力，作为免疫原诱导宿主保护免疫力等方面的作用；并简述了血吸虫ＨＳＰ７０的研究进展。     

日本血吸虫热休克蛋白70诱导BALB/c小鼠皮肤炎症反应的实验研究

目的 目的 观察重组日本血吸虫热休克蛋白70 （rSj648/hsp70） 诱导BALB/c小鼠皮肤炎症反应的变化情况。 方法 方法 BALB/c小鼠经腹部皮内分别免疫注射LPS （20 μg/只）、 rSj648/hsp70 （100 μg/只）, 同时设PBS处理组为空白对照。通过苏木素伊红 （HE） 染色观察免疫后第1、 2、 4、 7天小鼠腹部皮肤的炎症反应变化, 并利用Real?time PCR方法检测不同时间点各组小鼠皮肤组织IFN?γ mRNA的表达水平。 结果 结果 通过HE染色观察发现LPS组小鼠腹部皮肤组织在免疫后第1天炎症细胞浸润明显, 之后炎症反应开始逐渐减轻; 与LPS组相比较, rSj648/hsp70组小鼠腹部皮肤炎症反应强度大, 持续时间长,直至免疫后第7天炎症反应仍明显。Real?time PCR结果显示, 免疫后第1天, LPS组和rSj648/hsp70组小鼠皮肤组织的IFN? γ mRNA表达水平均升高, 之后LPS组逐渐降低, 而rSj648/hsp70组直至免疫后第7天仍持续高表达。 结论 结论 rSj648/hsp70 能使小鼠皮肤出现较强的以诱导产生IFN?γ为主的Th1优势免疫应答, 进一步提示了HSP70高表达可能与致弱尾蚴诱导宿主产生抗感染免疫力有关。     

日本血吸虫40 kDa热休克蛋白对巨噬细胞活化的影响

目的构建pGEX 6P 1 SjHSP40(SjHSP40)融合表达载体并在大肠埃希菌(Escherich coli)内进行原核表达及重组蛋白纯化,以探讨SjHSP40对巨噬细胞活化的影响。方法以PCR方法扩增SjHSP40基因片段,将其克隆入原核表达质粒pGEX 6P 1,经测序验证后转化入E.coli BL21(DE3)中。重组蛋白经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达后以Glutathione Sepharose 4B亲和柱进行纯化。所得产物GST SjHSP40进行十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS PAGE)、Westernblot鉴定。将此融合蛋白负载巨噬细胞48 h后,用流式细胞术检测巨噬细胞表面分子。结果测序结果表明,本研究成功构建了pGEX 6P 1 SjHSP40原核表达载体,经IPTG诱导表达出融合蛋白。Western blot显示该融合蛋白能被抗GST抗体特异性识别。与GST等对照组相比,此融合蛋白负载的巨噬细胞表面共刺激分子(CD40、CD80、CD86)及MHCⅡ分子表达显著上调。结论 SjHSP40可显著上调巨噬细胞表面共刺激分子(CD40、CD80、CD86)及MHCⅡ分子的表达,提示其可在一定程度上使巨噬细胞活化。     

寄生虫热休克蛋白及其在血吸虫方面的研究进展

本文以HSP_(70)和HSP_(90)为例,简述了热休克蛋白的功能及基因表达调控、寄生虫热休克蛋白参与寄生虫分化并增强其毒力、作为免疫原诱导宿主保护性免疫力等方面的作用;并简述了血吸虫HSP_(70)的研究进展。     

日本血吸虫热休克蛋白60 kDa的免疫原性及保护性研究

目的研究日本血吸虫热休克蛋白60 kDa(SjHSP60)免疫原性,评价其免疫保护性及可能机制。方法通过在线生物信息学软件预测SjHSP60的B细胞表位,随后用SjHSP60免疫BALB/c小鼠后检测特异性抗体水平和淋巴细胞增殖以评估其免疫原性,进一步通过攻击感染实验观察其免疫保护效果;最后分选免疫小鼠的CD4~+CD25~+调节性T细胞(Treg)与CD4~+CD25~-T细胞共培养,通过细胞增殖实验检测CD4~+CD25~+Treg细胞的抑制功能。结果生物信息学预测结果显示,SjHSP60中存在多个B细胞表位的优势区段。SjHSP60可在小鼠体内诱导特异性抗体(P0.01),也可诱导小鼠脾细胞发生增殖(P0.01)和分泌IFN-γ(P0.01);但攻击感染实验显示,SjHSP60免疫小鼠体内虫荷(P0.05)、卵荷(P0.05)均未显著减少。体外共培养实验表明,SjHSP60可显著增强小鼠CD4~+CD25~+Treg细胞的免疫抑制功能(P0.01)。结论SjHSP60对宿主免疫系统可发挥"双刃剑"作用,即在诱导特异性抗感染免疫应答的同时又可增强免疫抑制功能,从而削弱了其免疫保护作用。     

水蛭热刺激分泌物与日本血吸虫成虫可溶性物质的免疫交叉反应性分析

目的分析水蛭热刺激分泌物(Wp-hs)与日本血吸虫成虫可溶性物质(Sj-Ds)间的共同组分,探讨两者之间免疫交叉反应的物质基础。方法通过升高温度刺激水蛭虫体产生Wp-hs,同时收集室温放置的水蛭分泌物作为对照,用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析Wp-hs与Sj-Ds之间的共同蛋白组分;将这些共同蛋白组分分别与日本血吸虫病患者混合血清、兔抗Wp-hs免疫血清、健康人混合血清进行斑点酶联免疫吸附试验和免疫印迹试验,找出具有免疫交叉反应活性的共同蛋白组分。结果Wp-hs与Sj-Ds之间存在着分子量(12.6~85.4kDa)相近的蛋白条带。Wp-hs抗原在21.6~95.4kDa分子量范围内与日本血吸虫病患者混合血清反应尤为明显,且不与正常人血清反应;Sj-Ds(40.1~89.0kDa)与兔抗Wp-hs免疫血清能较好的结合。结论Wp-hs与Sj-Ds之间至少存在3种具有免疫活性的共同蛋白组分。     

日本血吸虫MBLAC1基因的克隆及生物信息学分析

目的 克隆日本血吸虫金属β内酰胺酶结构域蛋白1(Metallo-beta-lactamases domain-containing protein 1,MBLAC1)基因,并研究其编码蛋白的生物学特性。方法 以成虫虫体cDNA为模板,利用PCR技术扩增SjMBLAC1基因,并通过生物信息学技术分析该基因编码蛋白的结构特征。结果 SjMBLAC1扩增基因片段大小为711 bp,编码236个氨基酸,预测蛋白质分子量约为26 kD,理论等电点为4.84。该蛋白的第7~222位氨基酸为保守结构域,属于MBL超级家族;不存在跨膜结构域及信号肽;具有一个N-糖基化位点,在第186位氨基酸;二级结构中包含α-螺旋8.90%、β-折叠27.97%、无规则卷曲区域63.14%,推测SjMBLAC1蛋白具有9个优势B细胞抗原表位。结论 成功克隆了SjMBLAC1基因并对其编码蛋白进行了生物信息学分析,从而为开展该蛋白的生物学功能研究及筛选抗血吸虫病疫苗候选分子提供了基础。     

抗日本血吸虫循环抗原噬菌体抗体基因结构分析

目的 对获得的抗日本血吸虫循环抗原的抗体克隆进行基因分析。方法 将2株阳性克隆抗体基因进行测序，并用NCBI和Ig Blast Analysis of lmmunoglobulin sequences中的软件，对DNA序列和由其推导的氨基酸序列进行分析，并对其二级结构进行了模拟。结果 B04和C24阳性克隆抗体基因的长度分别为708bp和732bp，轻链和重链可变区基因与小鼠免疫球蛋白基因有高度的同源性。推导的氨基酸序列均具有典型的抗体轻、重链可变区特征。对2株克隆抗体基因二级结构进行模拟，结果显示以β-折叠和转角为主的平行肽链形成片层样结构，均符合抗体的基本构型。结论 B04、C24阳性克隆外源基因均属于小鼠免疫球蛋白可变区基因。     

Molecular and serological characteristics of the glutathione S-transferases of Schistosoma japonicum and Schistosoma mansoni

When aqueous extracts of Schistosoma japonicum and S. mansoni adult worms are passed over columns of glutathione-conjugated agarose, two molecular species of Mr 26,000 and Mr 28,000 are detected in eluates as analysed by SDS-PAGE, these eluates having glutathione S-transferase (GST) activity. The molecules, termed Sj26 and Sj28 from S. japonicum and Sm26 and Sm28 from S. mansoni, can be immunogenic in rabbits or mice and appear not to be linked together as subunits of GST heterodimers. The elution profile of SjGST (Sj26+Sj28) from glutathione columns resembles that of SmGST (Sm26+Sm28) and, by peptide mapping, radioiodinated Sj26 and Sm26 are related as are the two Mr 28,000 molecules. Similarities between radioiodinated Sj28 and Sm28 are also obvious on two-dimensional gel electrophoresis with some differences being observed between Sj26 and Sm26. The Mr 28,000 molecules are more prominent than the Mr 26,000 molecules and, although Sj28 and Sm28 is a poor immunogen in mice, immunological cross-reactivity between Sj28 and Sm28 is generally more readily detected than that between Sj26 and Sm26. Whether experimental vaccination against schistosomiasis japonica and schistosomiasis mansoni reported with cloned GSTs can be improved by incorporation of both Mr 28,000 and Mr 26,000 species into the vaccine remains to be determined. On this point, the present data suggest that vaccination of mice with Sj26 plus Sm28 should be a useful means of increasing antibody responses to the GSTs of S. japonicum.     

日本血吸虫溶血磷脂酶编码基因真核表达载体的构建和表达及鉴定

目的 从日本血吸虫成虫cDNA中扩增出溶血磷脂酶编码基因(Si1539),并亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),旨在提取重组抗原进行免疫原性分析,并用于免疫学诊断.方法 提取日本血吸虫成虫总RNA,反转录生成cDNA,PCR法扩增出Sj1539基因,通过克隆载体pGEM-T连接,亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),然后转染至人宫颈癌细胞株(HeLa细胞)中表达,表达产物用Western印迹法进行鉴定.结果 Sj1539基因PCR扩增产物片段长度为684 bp.重组质粒pcDNA3.1(+)-Sj1539经BamH I、Xho I双酶切和PCR扩增鉴定,证实Sj1539基因已成功插入.重组质粒pcDNA3.1(+)-Sj1539在HeLa细胞中的表达产物经Western印迹法鉴定能够与日本血吸虫感染的兔血清反应,其相对分子质量(Mr)约为25×103.结论 成功构建了日本血吸虫Si1539基因真核表达载体,并获得了表达产物.

Abstract：

Objective Schistasoma japonicum(S.japonicum)lysophospholipase gene(Sjl539)from cDNA of S japonicum adult worms was amplified and subcloned into eukaryotic expression vector pcDNA3.1(+)for expression of recombinant antigen and immunogenicity analysis.Methods Total RNA of S.japonicum was extracted to generato cDNA by RT-PCR.The Sj1539 gent was amplified.The DNA fragment was subcloned into eukaryofic expression vector pcDNA3.1(+)following insertion and amplification in pGEM-T.The recombinant plasmid was transfected into human cervical carcinoma cell strain(Hela cells)and expression products were identified by Western blotting.Results The size of PCR product was approximately 684 bp.It was confirmed that Sj1539 gene had been inserted successfully by the recombinant plasmid digested with two enzymes and PCR.It was verified that the expression product could react with S.japonicum-infected rabbit serum by Western blotting and the molecular weight was approximately 25×103.Conclusions The eukaryotie expression vector carrying Sj1539 gene has been established and the expression product has been obtained.     

重组日本血吸虫铁蛋白的表达纯化及诱导小鼠保护性免疫研究

目的　表达、纯化重组日本血吸虫铁蛋白 ,观察其免疫小鼠后抗日本血吸虫的免疫保护作用。方法　用基因重组技术 ,将日本血吸虫铁蛋白基因亚克隆至表达载体 pGMC上 ;在IPTG诱导下 ,重组日本血吸虫铁蛋白得到高效表达 ;用电泳层析法分离纯化日本血吸虫铁蛋白 ;用SDS -PAGE和Western -blot鉴定表达纯化产物 ;用纯化的重组铁蛋白免疫小鼠三次 ,分别在 0、2、4周进行。第 6周每鼠经腹部感染 4 0± 1条日本血吸虫尾蚴。 4 2天后剖杀冲虫 ,计数虫数及肝卵数。结果　纯化的重组铁蛋白分子量为 4 0kD ,具有较好的免疫原性 ,能被日本血吸虫感染兔血清识别。与对照组相比 ,纯化重组铁蛋白免疫小鼠组的减虫率为 2 4 5 % ,减卵率为 4 5 8%。结论　重组日本血吸虫铁蛋白不仅在大肠杆菌中得到高效表达 ,而且纯化的铁蛋白分子能诱导抗日本血吸虫病的保护性免疫。     

日本血吸虫尾蚴弹性蛋白酶结构的生物信息学分析

目的分析日本血吸虫尾蚴弹性蛋白酶（SjCE）的结构,为药物靶标、疫苗研究提供参考。方法用Prot-param、SignalP、DNAMAN、SOSUI、Emini、BepiPred、MLRC、Geno3d等软件对SjCE的蛋白质理化参数、亲水性、可溶性、表面可及性、二级结构、三级结构、抗原表位等进行分析及预测。结果 SjCE由263个氨基酸残基组成,理论分子质量单位为28.5 ku,等电点为6.94,属于可溶蛋白;有6个表面可及性区域;BepiPred 1.0 Server预测有7个抗原表位;二级结构以无规则卷曲为主;三级结构分子建模显示,该蛋白含有丝氨酸蛋白酶活性部位,位于裂隙区的中间。结论 SjCE具有丝氨酸蛋白酶活性位点,是可溶性蛋白。该蛋白有6个潜在的抗原表位,是潜在的疫苗候选分子和药物作用靶标。     

日本血吸虫与曼氏血吸虫的致病差异

曼氏血吸虫和日本血吸虫是全球范围内两种主要的肠道血吸虫病病原体,所致基本病理均为虫卵引起的肝脏肉芽肿和纤维化,但两者在产卵方式以及肉芽肿的组成细胞等方面均存在明显差异。 目前,我国的血吸虫病研究主要以日本血吸虫病为对象,国外主要以曼氏血吸虫病为对象,而介绍两种血吸虫致病差异的综述较少。 为更好地理解两种血吸虫的致病差异,本文从血吸虫的基因组和进化路径、幼虫迁移、成虫寄生位置及产卵方式、局部组织病理、肉芽肿的形成机制以及肉芽肿的细胞组成等 6 个方面对日本血吸虫和曼氏血吸虫的致病差异进行了综述。