抗柯萨奇病毒A组2型单克隆抗体制备及ELISA抗原检测方法的建立

目的  制备抗柯萨奇病毒A组2型( coxsackievirus A2,CV-A2)单克隆抗体（单抗）,建立CV-A2抗原检测方法。方法  用纯化后的CV-A2全病毒颗粒免疫小鼠,筛选获得抗CV-A2单抗。建立CV-A2抗原检测方法,确定线性范围,对其准确度、精密度、稳定性、专属性进行验证。用 ELISA检测病毒颗粒纯化过程中样品的抗原含量。结果  制备了高效价的抗CV-A2单抗并建立 ELISA抗原检测方法,检测范围为5.00~320.00 ng/ml。高、中、低3个浓度样品准确度验证回收率在89.58%~104.78%之间。重复性验证变异系数分别为2.10%、2.47%、6.18%。中间精密度验证变异系数分别为2.89%、2.69%、1.94%。耐用性验证回收率在84.26%~114.21%之间。包被微孔板于37℃放置3d,样品回收率在90.31%~103.11%之间。专属性验证结果显示该方法只识别CV-A2抗原,与其他抗原均无交叉反应。结论  建立并验证了CV-A2 ELISA抗原检测方法,可应用于病毒纯化过程中样品的抗原检测,还可应用于含CV-A2的手足口病多价疫苗的CV-A2抗原含量检测。     

羊—猴轮状病毒基因重配株的组建与基因型分析

用羊轮状病毒Ｌｃ４０株（Ｇ１０型）和猴轮状病毒ＳＡ１１株（Ｇ３型）混合感染ＭＡ－１０４细胞，在无外界选择压力条件下，由第一代培养物随意挑取２８６个子代空斑克隆。根据病毒ＲＮＡ聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱进行基因型分析，其中Ｌｃ４０亲本株１２６个（４４．１％），ＳＡ１１亲本株１１５个（４０．２％），基因重配株４５个（１５．７％），呈现２０种重配基因型。两亲本株某些基因片段的重配频率为０．３５％～２．８０％     

柯萨奇病毒A组5型VP1蛋白原核表达及多克隆抗体的制备

目的 原核表达柯萨奇病毒A组5型(coxsackievirus A5,CV-A5)VP1蛋白,并制备抗VP1多克隆抗体(多抗),为CV-A5相关定性定量研究制备试剂。方法 逆转录PCR扩增N端截短的CV-A5VP1-ΔN56后,克隆至原核表达载体pGEX-6P-1,获得pGEX-6P-1-VP1-ΔN56。将其转化大肠埃希菌BL21(DE3),表达重组蛋白并纯化。用纯化的谷胱甘肽巯基转移酶-VP1-ΔN56融合蛋白经背部皮下免疫日本大耳白兔,制备多抗。结果 重组表达载体构建成功,融合蛋白以不可溶包涵体存在。ELISA、蛋白质印迹法检测表明,获得的兔多抗效价为107,可特异性识别重组和天然CV-A5 VP1蛋白。结论 成功制备重组CV-A5 VP1蛋白及特异性多抗。为中和抗原表征研究及VP1定性定量分析奠定了基础。     

湖北襄阳2016-2017年埃可病毒11型流行株基因特征分析

目的对2016—2017年中国湖北襄阳地区分离的埃可病毒11型(Echovirus 11,Echo11)基于VP1基因进行分子进化特征分析。方法采集2016—2017年中国湖北襄阳地区手足口病患儿肛拭子或咽拭子标本,应用real-time RT-PCR技术对肠道病毒阳性样本进行筛选,对肛拭子或咽拭子样本进行病毒分离。采用常规RT-PCR方法对在人横纹肌瘤细胞上分离的Echo11病毒襄阳流行株VP1区和3株代表株全长基因扩增并进行序列分析,使用DNAStar7.0软件包中的MegAlign、MEGA6.0中的Data和Phylogeny软件对核苷酸和氨基酸序列同源性、突变位点进行分析和构建系统进化树等。使用SimPlot软件进行重组分析,对3株代表株全长序列和GenBank中下载的核苷酸序列进行BootScan扫描,生成相似性图。结果本研究从3494份手足口病患儿样本中共分离出Echo11病毒11株,占比0.31%。11株Echo11流行株的VP1基因同源性比较高。核酸序列和氨基酸序列同源性分别为98.4%~100.0%和98.3%~100.0%。11株Echo11襄阳流行株与Echo11原型株(Echo11/Gregory,X80059)核酸序列和氨基酸序列同源性分别为73.9%~74.8%和87.7%~88.7%。襄阳地区流行的Echo11毒株均属于D进化分支,与中国大陆部分地区2013年以来的流行株亲缘关系相近。襄阳流行株和2010年Echo1河南流行株和2015年的Echo6湖北流行株在多个区域有较高的相似度,说明襄阳流行株基因组的多个区域可能发生了重组。结论襄阳地区流行的Echo11毒株均属于D进化分支,2016—2017年襄阳地区流行的Echo11是重组株。     

大鼠肝脏短期缺血再灌注损伤早期肝细胞超微结构观察

目的　探讨大鼠肝脏缺血再灌注损伤早期肝细胞超微结构的病理变化。方法　切取肝脏局部缺血再灌注模型大鼠肝脏组织 ,观察光镜及电镜下的组织学改变。结果　肝脏局部缺血再灌注模型大鼠肝细胞在缺血 4 0min后再灌注 90min时 ,达到不可逆性破坏。结论　实验大鼠肝脏组织的缺血时间应少于 4 0min。     

电镜法、ELISA法及核酸电泳法检测轮状病毒的比较研究

本文报告用电镜法、ELISA法和PAGE法检测142O份急性腹泻病儿粪便中轮状病毒的结果并进行了评价比较。三法相互对比的符合率:EM与ELISA为89.4％,EM与PAGE为90.3％,ELISA与PAGE为87.8％。实验结果表明三法检测的敏感性近似,均可作为检测轮状病毒的常规方法。文中对三法的特点做了讨论。     

CV-A4单克隆抗体制备及候选疫苗型特异性定量分析方法的建立和验证

为制备柯萨奇病毒A组4型(coxsackievirus A4,CV-A4)单克隆抗体并鉴定其生物学特性，同时为初步建立CV-A4抗原定量ELISA检测法，用于CV-A4候选疫苗研制中的抗原定量检测及质量控制，将纯化后的CV-A4全病毒颗粒免疫BALB/c小鼠，采用常规细胞融合技术、中和试验和ELISA获得CV-A4单克隆抗体；建立双抗体夹心ELISA检测法并进行方法学验证，用于检测手足口病(hand-foot-mouth disease, HFMD)多价疫苗中CV-A4抗原水平。结果显示，制备了型特异性CV-A4单克隆抗体并建立了双抗体夹心ELISA检测法，检测范围为62.5～4 000.0 ng/mL;高、中、低3个浓度样本准确度验证，回收率为91.8%～121.9%;重复性验证，变异系数分别为3.4%、11.9%和8.6%;中间精密度验证，变异系数分别为1.8%、9.4%和6.5%;耐用性验证，回收率为97.3%～104.1%;包被微孔板37℃放置3 d,样本回收率为98.5%～119.2%;在特异度验证中，双抗体夹心ELISA检测法仅识别CV-A4抗原，与CV-A4以外的抗原均无...