传染性非典型肺炎疫苗的研制:重组真核质粒PVAX1/SARS-CoVM的构建及免疫原性研究

目的:构建真核表达质粒PVAX1/M,免疫Balb/c小鼠,测定其诱导的特异性免疫应答,探讨传染性非典型肺炎(severeacuteresperatorysyn-drome,SARS)防治和康复的可能手段。方法:根据GenBank中登录的SARS-CoVM蛋白基因序列设计引物,采用反转录聚合酶链反应方法从感染SARS病毒的VeroE6细胞中扩增得到约666bp的片段,构建重组真核表达质粒PVAX1/M。体外转染COS-7细胞,细胞免疫化学方法鉴定目的蛋白的表达后,肌肉注射免疫Balb/c小鼠(雌性,6周龄),加强免疫3次后,测定其诱导免疫应答的能力。结果:构建的重组质粒经酶切及测序鉴定,与GenBank中登录的序列完全一致;细胞免疫化学方法均显示重组质粒可在COS-7细胞中表达有免疫原性的SARS-CoVM蛋白;免疫小鼠血清中检测到较高滴度的抗体,并能诱导特异性的CTL反应。结论:成功构建真核表达质粒PVAX1/SARS-CoVM,并能诱导小鼠产生特异性的免疫应答,为SARS的预防康复提供了可能的治疗手段。     

无神经症状不稳定胸腰椎爆裂性骨折的手术疗效分析

目的探讨无神经症状不稳定胸腰椎爆裂性骨折的手术疗效。方法回顾性分析我院收治的26例无神经症状不稳定胸腰椎爆裂性骨折患者的临床资料,采用后路标准切口脊柱椎弓根螺钉内固定的方式进行手术治疗,并观察和分析治疗效果。结果术后随访6个月-24个月,平均16个月,椎体前缘的高度、椎体后凸Cobb角与术前相比均明显改善,腰背疼痛消失,疗效满意。结论采用后路标准切口脊柱椎弓根螺钉内固定的方式治疗无神经症状不稳定胸腰椎爆裂性骨折,不但可以使骨折快速的复位,而且还能防止继发后凸畸形及腰背疼痛。     

猪圆环病毒2型CAP蛋白新型表位抗原肽的设计、合成及免疫原性研究

目的设计合成PCV2 CAP的B细胞表位抗原肽并对其进行鉴定。方法采用DNAStar和BcePred分析软件并结合吴玉章氨基酸抗原指数计算方法预测PCV2 CAP的B细胞表位,以此合成4分支多重抗原肽结构,同时串联一个通用型Th表位;采用Fmoc法合成4分支PCV2 CAP多重抗原肽(MAP),通过高效反相液相色谱(RP-HPLC)、质谱(MS)分析对其进行初步鉴定。以合成的抗原肽免疫昆明系小鼠及兔,观察体液免疫反应。结果初步筛选出3种抗原指数较高的表位,即98~103aa(命名为B98),156~162aa(命名为B156),228~233aa(命名为B228);合成的多重抗原肽经RP-HPLC层析后,纯度达到92.49%,MS鉴定其相对分子质量一致,误差小于0.1%。以合成的MAP疫苗免疫小鼠及兔后,可产生高滴度的特异性抗PCV2 CAP抗体。结论 PCV2 CAP的B细胞新表位多重抗原肽有免疫原作用,将为PCV2 CAP表位肽疫苗的研究奠定基础。     

重庆地区2004年12月～2005年4月犬狂犬病流行毒株的检测

目的 确诊重庆地区2004年12月至2005年4月发生的临床疑似犬狂犬病，分离病毒并分析病毒株的进化关系。方法 RT，PCR检测重庆地区的5例临床疑似狂犬脑组织样品，乳鼠脑内接种试验分离病毒，分析5个流行毒株间及其与占各基因型代表毒株的遗传衍化关系。结果 5例临床样品均含有狂犬病毒，分离获得了相应的5株流行毒，CQ／ws-1，aQ／wx-1，aQ／w1-1，CQ／fj-1和CQ／qj-1。N基因核酸序列和推导氨基酸序列的同源性分析表明所获毒株均归属于基因Ⅰ型狂犬病毒：在基因Ⅰ型的同源性比较中，分离毒株CQ／qj-1与中国狂犬病人用疫苗株3aG型最低，为83．1％，氨基酸水平同源性最低为90．2％（3aG与CQ／ws-1）。分离毒株间低低为97．5％。同源性分析结果还显示出，尽管CQ／WS-1，CQ／wx-1和CQ／fj-1分别来自紧密相邻的3个地区，可是CQ／fj-1却与其它的两个毒株的基因水平同源性最高仅为95．6％。结论 5例临床疑似病例均为犬狂犬病，新分离的动物狂犬病毒流行毒株均为基因Ⅰ型，而且毒株间存在遗传变异。     

布鲁氏菌DNA疫苗的发展：过去、现在和未来

布鲁氏菌病(Brucellosis)是目前世界上流行最广，危害最大的人畜共患病之一，其致病菌为胞内寄生的革兰氏阴性杆菌，感染机体后主要激发细胞保护性免疫反应。新兴的DNA疫苗将表达的目的蛋白以肽的形式递呈给MHCI后能激活抗原特异性T细胞，诱发细胞介导的免疫反应，为控制布鲁氏菌病提供了一条可行途径。1997年第一种布鲁氏菌DNA疫苗pCDNA3-L7／L12构建成功并在动物实验中表现出了潜在的应用前景。本文介绍了现有的目前几种较为成功的布鲁氏菌DNA疫苗，分析其优、缺点，并探讨了未来提高其免疫效果的可能途径。     

人感染H7N9禽流感肺炎CT表现与病毒载量及CD4+T淋巴细胞的相关性

【摘要】目的：探讨人感染H7N9禽流感肺炎CT扫描半定量评分与病毒载量、CD4+T淋巴细胞数量的动态变化及相关性。方法：搜集2013年12月-2014年2月本院确诊的9例人感染H7N9禽流感患者的临床资料,所有患者入院后行每日病毒M片段Ct值测定、血常规及T淋巴细胞亚群检测、定期胸部CT扫描,根据CT表现进行半定量评分,观察三者的变化,并进行统计学分析。结果：病程早期（≤4d）：明确诊断2例,病毒M片段Ct值分别为34.28和30.48。3例患者病程早期共行4次胸部CT扫描和T淋巴细胞亚群检测,CT表现半定量评分平均为3.68±1.25,CD4+T淋巴细胞数平均为33.03±3.34。病程进展期（5d≤d≤10d）：病程的第5～7天病毒M片段Ct值达到低值28.72±3.88,8～10d病毒M片段Ct值增加为30.57±3.07,但两者差异无统计学意义（t=0.747,P＞0.05）。肺炎CT表现评分和CD4+T淋巴细胞变化略滞后于病毒载量变化,于8～10d CT表现评分达到峰值（12.94±6.10）,与早期相比,CT评分均值增加50%,而CD4+T淋巴细胞数降低为24.39±5.15。病程恢复期（≥11d）,此期病毒载量下降或转阴,CD4+T淋巴细胞数恢复正常,肺部病灶吸收减少。结论：在病变进展期,人感染H7N9禽流感病毒载量、CD4+T淋巴细胞与胸部CT表现半定量评分存在一定相关性。监测三者的变化趋势,对临床疗效评估及预后判断具有重要意义。     

剪切波速对比磁共振弥散成像评价慢性乙型肝炎肝纤维化程度

目的对比研究剪切波速与磁共振体素内不连贯运动弥散成像技术对慢性乙型肝炎(以下简称慢乙肝)肝纤维化程度进行无创性分期的价值。方法入选223例经病理证实肝纤维化程度的慢乙肝患者,将其分为轻微肝纤维化(F1)组、肝纤维化(F2)组、严重肝纤维化(F3)组、肝硬化(F4)组。80例健康体检者组成对照(F0)组,测量所有入选者肝右叶各段剪切波速及其均值。应用磁共振弥散成像技术获得其中不同病理分期的39例肝纤维化患者及19例健康体检者的弥散值(D)、弥漫分数(f)及灌注相关弥散值(D*)。结果 5组间剪切波速结果两两比较,除对照组与F1组间s5肝段剪切波速差异无统计学意义(P>0.05),其余肝段剪切波速及其均值差异均有统计学意义(P<0.05),且随着肝纤维化程度的加重,剪切波速逐级递增。剪切波速诊断≥F1、≥F2、≥F3及F4的临界值分别为1.22 m/s、1.30 m/s、1.45 m/s及1.60 m/s,在非严重型肝纤维化(F1、F2)诊断方面,剪切波速有较高的敏感度,分别达到92.82%、90.12%,而对于严重的肝纤维化及肝硬化(F3、F4),剪切波速则具有极佳的特异度,分别达到92.27%、95.93%,其诊断各期(≥F1、≥F2、≥F3、F4)肝纤维化的受试者工作特征曲线下面积(area under the receiver operating characteristic curve,AUROC)分别达到0.887、0.920、0.952、0.954。磁共振弥散成像方面,与对照组比较,肝纤维化患者的D、f、D*均显著减低(P<0.05),且随着肝纤维化程度的加重,f值和D*值持续减低,差异有统计学意义(P<0.05)。f值和D*值具有区分肝纤维化F2期与F1期的能力,最佳诊断分界点分别是0.135、9.928×10-3mm2/s。结论对比剪切波速可细分F2以上级慢乙肝肝纤维化程度,磁共振体素内不连贯运动弥散成像则能将F1期与其他期肝纤维化精确区分,二者联合应用值得临床推广。     

重组金葡萄球菌肠毒素B纯化工艺研究

目的建立无降解、高纯度的重组金葡萄球菌肠毒素B(Staphylococcal enterotoxin B,SEB)的纯化工艺,并检测活性以考察纯化工艺对蛋白的影响。方法用PBV220表达载体诱导表达出重组SEB后,采用(NH4)2SO4粗纯—疏水层析—离子交换色谱的组合纯化法纯化该蛋白。纯化后的样品经Western-blot鉴定及动物致死实验检测活性。结果通过该纯化工艺得到了纯度高(纯度>99%),稳定性高的重组SEB,其活性与天然SEB蛋白无明显差异,保持了高活性。结论本实验建立了无降解、高纯度、高活性的重组SEB的纯化工艺,为进一步研究SEB的临床应用打下了基础。     

人感染H7N9禽流感病毒性重症肺炎的影像学表现及动态变化特点

【摘要】目的：探讨人感染H7N9禽流感病毒性重症肺炎的影像学检查方法及胸部X线、CT影像表现及动态变化特点。方法：对17例(男9例,女8例)确诊人感染H7N9禽流感病毒性重症肺炎患者行胸部X线摄片和薄层CT扫描检查,由2名影像学专家对其影像表现及动态变化进行评价分析。结果:①早期病变位于一侧肺下叶15例,位于上肺叶者2例。进展期病变累及双侧肺16例（16/17,94.1％）,累及一侧肺叶1例（1/17,5.9％）,病变累及4～6个肺叶共16例（94.1％）。②早期和进展期影像学表现见磨玻璃样影和/或肺实变影17例(17/17,100%);13例患者出现胸膜腔积液(13/17,76.5%)。③恢复期主要表现为多发小斑片影（14例）、片状磨玻璃影（9例）、条索状影（16例）及肺气囊（3例）。出院前胸部CT检查以网格状及胸膜下线影（6例）间隔旁肺气肿、瘢痕型肺气肿及纵隔旁胸膜下肺大疱等（4例）为主。2例合并有鲍曼不动杆菌感染,其中1例还合并双侧股骨头缺血坏死。有15例符合最早出现的病灶晚吸收,较晚出现的病灶最早吸收的特点。结论:人感染H7N9禽流感病毒性重症肺炎患者具有明显磨玻璃样影及肺实变表现,病灶以两下叶及背部为著,变化快且广泛,病灶吸收缓慢,恢复期见肺纤维化等特点。影像学的动态观察对指导临床诊断、治疗以及判断预后有一定价值。     

SARS-CoV基因重组质粒的构建与表达

目的　针对SARS冠状病毒 (SARS CoV)M、N、S和E蛋白 ,构建 4种重组真核表达质粒pVAX1 M、pVAX1 N、pVAX1 S和pVAX1 E ,为研制SARSDNA疫苗奠定基础。方法　根据GenBank中SARS病毒基因序列分别设计M、N、S和E引物 ,用RT PCR方法从感染SARS病毒的Vero E6细胞中扩增得到M、N、S和E片段 ,构建重组质粒pVAX1 M、pVAX1 N、pVAX1 S和pVAX1 E。并以重组质粒转染COS 7细胞 ,用免疫细胞化学和Westernblot方法鉴定重组质粒体外的表达。结果　经酶切鉴定及DNA序列测定证实重组质粒构建正确 ,细胞转染实验表明 ,构建的 4种重组质粒均能在COS 7细胞内表达。结论　成功构建 4种SARS CoV 4种蛋白抗原真核表达质粒 ,并能在真核细胞内获得表达。