Jagged1过表达促进老龄大鼠来源的内皮祖细胞向成熟内皮细胞分化

 目的：探讨上调Jagged1表达对内皮培养条件下老龄大鼠来源的内皮祖细胞（EPC）向内皮细胞分化的影响。方法：脱臼处死1～2月龄和19～26月龄SD大鼠,PBS冲洗股骨和胫骨骨髓,Ficoll密度梯度离心分离单个核细胞, 应用含10% FBS的DMEM/F12培养基以差速贴壁法进行体外培养,DiI-ac-LDL与FITC-UEA-1荧光双染进行EPC特性鉴定。实验分为4组：对照组、PIRES2-EGFP转染组、PIRES2-EGFP-Jagged1转染组和未转染的年轻大鼠来源EPC组。荧光显微镜下计数GFP阳性细胞数并计算转染效率;免疫荧光、RT-PCR和Western blotting检测Jagged1 mRNA和蛋白、von Willebrand因子（vWF）及血管内皮生长因子激酶插入区受体（KDR）mRNA表达,体外血管生成实验检测EPC的血管形成能力。结果：转染后Jagged1在EGFP-Jagged1组表达较对照组显著增强（P<0.01）;Jagged1过表达显著促进老龄大鼠EPC vWF与KDR mRNA表达（P<0.01）和体外血管生成能力（P<0.01）; vWF与KDR mRNA表达以及体外血管生成能力在Jagged1转染组与年轻大鼠EPC组间未见有显著差别。结论：Jagged1过表达促进内皮培养条件下老龄大鼠来源EPC向成熟内皮细胞分化。     

Notch信号通路介导血小板源生长因子AA诱导的血管平滑肌细胞增殖和迁移

目的探讨Notch信号通路在血小板源生长因子AA(PDGF-AA)诱导血管平滑肌细胞(VSMC)增殖和迁移中的作用及机制。方法脱臼处死1~2月龄雄性SD大鼠,无菌取腹主动脉,剥弃外膜及去除内皮后,贴块法培养VSMC,α-SM-actin染色鉴定。实验分为四组:对照组、γ-secretase抑制剂组(DAPT组)、PDGF-AA组和PDGFAA+γ-secretase抑制剂组(PDGF-AA+DAPT组)。实时荧光定量PCR(Real-time q PCR)检测Notch信号分子mRNA表达;Cell Titer96 Aqueous One Solution试剂盒检测细胞增殖活性;采用细胞划痕实验检测VSMC的迁移能力。结果腹主动脉VSMC表达Notch信号通路Jagged1、Jagged2、Notch1~3等几种主要的配体及受体;PDGF-AA刺激24h和48 h后分别导致Jagged2和Jagged1 mRNA表达显著增强(P0.01,n=4);与0 h相比,PDGF-AA刺激72 h后,Notch1、Notch3 mRNA表达显著增高(P0.01,n=4),而刺激24 h后Notch2 mRNA表达显著降低。PDGF-AA显著促进HES1(P0.05,n=4)、HEY2(P0.05,n=4)和转录因子Rbp-jКmRNA(P0.05,n=4)表达,DAPT抑制PDGF-AA介导的HES1、HEY2 mRNA表达增强(P0.01,n=4),但是进一步促进PDGF-AA诱导的Rbp-jКmRNA表达(P0.05,n=4);PDGF-AA刺激促进VSMC增殖(P0.01,n=5)和减少划痕余留面积(P0.01,n=4),两种效应均可被DAPT显著阻抑(P0.01,n=4)。结论 PDGF-AA调节了VSMC Notch信号分子表达,PDGF-AA部分通过激活Notch信号通路调节VSMC的增殖和迁移。     

供体年龄影响融合生长内皮祖细胞对平滑肌细胞表型转换及增殖迁移的作用

目的:探讨老龄和年轻个体来源融合生长状态内皮祖细胞(EPCs)对血管平滑肌细胞(SMCs)表型转换以及增殖和迁移的调节作用。方法:脱臼处死1~2月龄、19~26月龄SD大鼠,应用含15%FBS的DMEM/F12培养基(含内皮细胞生长添加剂100 mg/L、肝素100 mg/L、青霉素、链霉素各1×105U/L)培养EPCs,取1~2月龄大鼠腹主动脉,组织块法培养血管SMCs,应用Di I-Ac-LDL与FITC-UEA-1荧光双染以及α-SM-actin免疫荧光分别对EPCs和SMCs进行鉴定。建立细胞共培养体系,上室为融合生长状态的EPCs,下室为SMCs,实验分4组:(1)第3代SMCs(P3)组;(2)第4代SMCs(P4)组;(3)第4代SMCs与年轻大鼠来源EPCs共培养(P4YE)组;(4)第4代SMCs与老龄大鼠来源EPCs共培养(P4AE)组。Western blotting检测α-SM-actin和osteopontin蛋白的表达;[3H]-TdR掺入法检测SMCs增殖;细胞划痕实验检测SMCs的迁移能力。结果:与P3组相比,P4组的SMCsα-SM-actin表达显著下调,而osteopontin表达显著增强;P4YE组SMCs的α-SM-actin及osteopontin表达与P3组比较未见有显著差别;与P4组相比,年轻和老龄大鼠来源的EPCs均显著促进第4代SMCs的α-SM-actin和下调osteopontin的表达,抑制第4代SMCs的增殖和迁移;与老龄大鼠来源的EPCs相比,年轻大鼠来源的EPCs更能够显著延迟SMCs表型由收缩型向合成型转换,抑制SMCs增殖和迁移。结论:共培养融合生长状态的EPCs使血管SMCs表型转换延迟、抑制SMCs增殖和迁移,年轻大鼠来源的EPCs较老龄大鼠来源的EPC更显著延迟血管SMCs表型由收缩型向合成型转换,并具有更强的抑制血管SMCs增殖和迁移的能力。