斑点免疫结合法测定卵黄抗体的活性

背景:哺乳动物产生的抗体和鸡产生的卵黄抗体在物理、生物活性方面存在差异。卵黄抗体能耐酸耐热,可口服用来防治动物和人类的肠内感染疾病,且对发展常规的诊断免疫实验有益。传统的ELISA法检测卵黄抗体比斑点免疫结合法费时。目的:应用斑点免疫结合法检测卵黄抗体的稳定性。设计:开放性实验。单位:解放军成都军区昆明总医院输血科。材料:实验于2006-01/06在解放军成都军区昆明总医院完成。选取30周龄的白色莱杭母鸡2只,以HLA-A*0201α链作为抗原,纯化抗原的总蛋白浓度0.04g/L,相对分子质量为32000(自行制备);硝酸纤维素膜(进口分装);脱脂奶粉(安怡产品,批号20051220);DAB(博士德公司);辛酸(上海星火化工厂生产);硫酸铵(汕头市光华化学厂生产)。方法:①抗原HLA-A*0201α链以总蛋白浓度0.04g/L纯化后,进行鸡卵黄抗体的纯化,采用SDS-PAGE电泳检测卵黄抗体的纯化结果。②1μL抗原被点样在硝酸纤维素膜的中心,于37℃孵箱中烤干,浸于1mL的PBST中,37℃孵箱90r/min封闭振荡15min,重新更换1mL的PBST,加入一抗卵黄抗体,终浓度为10mg/L。在37℃孵箱振荡30min后,硝酸纤维素膜用PBST洗3次。加入二抗标记HRP的鼠抗鸡卵黄抗体,孵育30min后,硝酸纤维素膜用PBST洗3次,通过用DAB试剂孵育来显色。阳性反应产生一个深棕色的斑点,表明卵黄抗体具有较好的活性;斑点变浅表明失去部分活性;斑点消失表明失去全部活性。根据斑点的灰度值变化对照标准样品,可计算卵黄抗体剩余的百分活性。③卵黄抗体用磷酸盐缓冲液调整为1,0.1,0.01g/L3种蛋白浓度,室温下放置4个月,每个月分别从各种浓度的样品中取10μg,采用斑点免疫结合法检测卵黄抗体室温稳定性。④卵黄抗体分别置于7个EP管,100μL/管,编号1～7。1～3号管用1mol/L的HCL分别调整pH值为5,3,2;4～6号管用1mol/L的NaOH分别调整pH值为9,11,12;7号管的pH值为7(中性),不加酸或碱。1～7号管均放在37℃孵箱中3h,每隔1h各管分别取10μg样品,采用斑点免疫结合法检测卵黄抗体不同pH值条件下的稳定性。⑤卵黄抗体分别置于6个EP管,10μL/管,编号1～6。按顺序编号各管分别于30,40,50,60,70,80℃水浴15min,然后4℃冰箱冷却,每管取样10μg,以未经过加热处理的样品作为标准对照,采用斑点免疫结合法检测卵黄抗体热稳定性。主要观察指标:①卵黄抗体SDS-PAGE电泳检测。②卵黄抗体室温稳定性检测。③卵黄抗体不同pH值稳定性检测结果。④卵黄抗体热稳定性检测。结果:①纯化的卵黄抗体经SDS-PAGE电泳后有两条主带,重链相对分子质量约66000,轻链相对分子质量约25000。②1,0.1,0.01g/L的卵黄抗体,室温下放置4个月后仍然保留部分活性。③pH5～9时37℃孵育3h后,卵黄抗体仍有部分活性;在pH低于5或高于9的条件下37℃孵育3h后,卵黄抗体失去全部活性。④纯化的卵黄抗体分别置于6个EP管中,1～4号管的卵黄抗体仍有活性,第5管和第6管出现白色沉淀,可能是较高温度下蛋白变性引起的。结论:卵黄抗体稳定性较好,斑点免疫结合法能够快速简单的证明和描述卵黄抗体的功能活性,且只需要微量抗原和抗体,斑点特异,能同时处理大量样品。     

树鼩血清与多种二抗的交叉反应:可在树鼩疾病动物模型中广泛应用

背景:由于树鼩是介于食虫目和灵长目之间的代表,进化程度高,较价廉的灵长类动物,医学生物学的用途很高,已受到广大学者的重视。目的:检测通常用的二抗能否与树鼩的血清发生免疫反应。方法:用Western和ELISA的方法检测树鼩的血清是否与抗兔、抗羊、抗人、抗小鼠、抗大鼠、抗猴的二抗发生交叉反应。结果与结论:Western结果表明树鼩的血清与抗兔、抗羊、抗人、抗小鼠、抗大鼠的二抗均不发生反应,与抗猴的二抗有交叉反应。ELISA的结果也表明树鼩的血清与抗猴的二抗有交叉反应,而与其他二抗没有交叉反应。结果说明通常卖的二抗不能用于树鼩IgG的免疫检测,只有抗猴的二抗与树鼩的血清发生交叉反应,必需制备抗树鼩IgG的单克隆和多克隆抗体,在没有现成抗体可用时,可采用抗猴的二抗替代检测,能在树鼩疾病动物模型的研究中得到广泛应用。     

诊断系统性红斑狼疮新的疾病标志

正系统性红斑狼疮(SLE)是一种慢性多因素炎症紊乱,由免疫系统变化引起,和基因、环境和激素相互作用引发的一种疾病。超过80%的患者有皮肤和黏膜受累,内部器官受累是病死率增加的一个主要原因。SLE的临床表现是它复杂的免疫病理的结果,包括产生自身抗体和免疫复合物性血管炎,上皮细胞损伤导致的血管破坏和严重的内部器官功能紊乱。SLE肾活检受累率几乎100%,而临床表现肾损伤占45%     

巨细胞病毒pp65抗原检测的新方法

目的传统的检测CMVpp65抗原的方法是间接免疫荧光,操作麻烦,步骤较多,整个实验需要6个多小时,而且只能定性。需要寻找一种简便的可以定量的方法来检测CMVpp65抗原阳性细胞。因此我们设计了流式的方法来检测CMVpp65抗原阳性细胞。方法我们用间接免疫荧光试剂盒中的一抗和购自invitrogen公司的二抗进行了流式标记移植病人外周血中的WBC,操作步骤明显简便了,只需不到2 h就可完成检测,而且可以定量检测CMVpp65抗原阳性细胞。同时我们用荧光定量PCR检测病人尿中的CMV基因的拷贝数。结果流式检测阳性率高的标本,用间接免疫荧光方法检测也为阳性,同时流式检测强阳性的病人尿用荧光定量PCR检测到CMV基因,表明病人处于CMV病毒血症。结论我们用间接免疫荧光试剂盒中的一抗和购自invitrogen公司的二抗进行流式标记,成功检测了移植病人的CMVpp65抗原阳性细胞的百分比,新方法可以定量,与荧光定量PCR方法检测病人尿中的CMV基因的结果符合率较高,可以推广应用。     

Jagged1过表达促进老龄大鼠来源的内皮祖细胞向成熟内皮细胞分化

 目的：探讨上调Jagged1表达对内皮培养条件下老龄大鼠来源的内皮祖细胞（EPC）向内皮细胞分化的影响。方法：脱臼处死1～2月龄和19～26月龄SD大鼠,PBS冲洗股骨和胫骨骨髓,Ficoll密度梯度离心分离单个核细胞, 应用含10% FBS的DMEM/F12培养基以差速贴壁法进行体外培养,DiI-ac-LDL与FITC-UEA-1荧光双染进行EPC特性鉴定。实验分为4组：对照组、PIRES2-EGFP转染组、PIRES2-EGFP-Jagged1转染组和未转染的年轻大鼠来源EPC组。荧光显微镜下计数GFP阳性细胞数并计算转染效率;免疫荧光、RT-PCR和Western blotting检测Jagged1 mRNA和蛋白、von Willebrand因子（vWF）及血管内皮生长因子激酶插入区受体（KDR）mRNA表达,体外血管生成实验检测EPC的血管形成能力。结果：转染后Jagged1在EGFP-Jagged1组表达较对照组显著增强（P<0.01）;Jagged1过表达显著促进老龄大鼠EPC vWF与KDR mRNA表达（P<0.01）和体外血管生成能力（P<0.01）; vWF与KDR mRNA表达以及体外血管生成能力在Jagged1转染组与年轻大鼠EPC组间未见有显著差别。结论：Jagged1过表达促进内皮培养条件下老龄大鼠来源EPC向成熟内皮细胞分化。     

引起胎儿和新生儿溶血性疾病的抗体研究进展

胎儿和新生儿的溶血性疾病是临床上常见的疾病，会引起流产、死胎、新生儿高胆红素血症和溶血，严重时会发展到核黄疸、永久性脑损伤和婴儿死亡。近年来对引起胎儿和新生儿的溶血性疾病的抗体进行了广泛研究，现将研究进展综述如下。     

巨细胞病毒疾病的研究进展

巨细胞病毒(CMV)感染在免疫功能受抑制的患者中常见,而抗病毒药物的大量使用具有毒性和严重不良反应。近年来,研究者开始尝试CMV特异T细胞回输的免疫治疗,取得了一定的进展。为了更充分地了解CMV疾病的特点,现综述CMV疾病最近几年的研究进展,为今后的研究提供参考。     

监测TCR CDR3漂移的免疫扫描谱型分析技术的建立与鉴定

外周血95％ T淋巴细胞的TCR由α（胚系基因中AV、AJ、AC重排）、β（胚系基因中的BV、BD、BJ、BC重排）两条多肽链组成，不同V（D）J重排后，由V基因末端、J基因前端和V-J（或V—D和D—J）连接时中间插入的核苷酸序列，分别组成了特异的TCRα和8的CDR3基因谱型的多样性。一种CDR3序列代表一个T细胞克隆，测定特定CDR3序列出现的频率可以反映特定T细胞克隆扩增的程度和功能状态。     

外周血干细胞移植供者66名心理健康调查

目的 了解已作为治疗恶性血液病和某些实体肿瘤常规手段的外周血干细胞移植干细胞供者的心理健康状况.方法 纳入2001-10/2005-09解放军成都军区昆明总医院成都军区血液中心外周血干细胞移植供者66名为观察对象.男58例,女8例,根据异体移植或自体移植分为两组：异体移植24例,自体移植42例.外周血干细胞移植前填写症状自评量表,对外周血干细胞移植供者症状自评量表各因子分与血小板单采献血者及“常模”进行比较.结果 共发放问卷66份,收回完整答卷66份,全部进入结果分析.①外周血干细胞异体移植供者与自体移植患者所有症状自评量表各因子差异均有显著性意义（P＜0.01）.②异体移植供者躯体化、焦虑、恐怖、偏执、精神病性分值均高于血小板单采献血者（P＜0.01）,所有因子分均显著高于中国正常人常模（P＜0.01）.③自体移植患者除躯体化外其他因子均显著高于血小板单采献血者（P＜0.01）,除强迫症状、敌对、精神病性其他因子显著高于常模（P＜0.01）.结论 外周血干细胞移植供者在移植采集时存在一定的心理健康问题,应加大公共卫生宣传力度,作好外周血干细胞移植供者的心理指导和护理,以提高其心理健康水平.