Remicade调节强直性脊柱炎患者滑膜细胞基因表达谱的初步研究

目的　通过比较抗肿瘤坏死因子 (TNF) α单克隆抗体Remicade治疗强直性脊柱炎(AS)病人前后的膝关节滑膜细胞的基因谱变化 ,筛选出Remicade效应相关的差异表达基因 ,并探讨其在AS发病机制中的意义。方法　用 5例活动期AS病人在Remicade治疗前和 3个月后 (每次 5mg/kg ,第 0、2、6、12周静脉注射 ,以后每 8周用 1次 )的膝关节滑膜细胞 ,提取总RNA ;微阵列基因检测用含 1176个基因的cDNA芯片进行 ;数据用GeneSpring 5 1软件进行基因差异表达和聚类分析。结果　 5例AS病人在Remicade治疗前后滑膜细胞基因差异表达和变化趋势总体聚类分析结果显示基因谱相关性强。用K mean聚类分析 ,其中第 5组与炎症相关密切的基因主要包括细胞因子、金属蛋白酶、黏附分子、与凋亡和致癌有关基因、受体、信号转导有关基因等。再按基因功能聚类 ,其中在致癌基因组共有 10个基因。比较AS病人治疗前后的关节滑膜细胞基因表达差异有显著性的基因(P <0 0 5 )共 4 5个 ,其中下调基因 4 4个 ;治疗后下调的基因主要包括三组 :①Th1细胞因子干扰素(IFN) γ ;②黏附分子 (VCAM 1、ICAM 1,Integrinβ4 ) ;③金属蛋白酶家系成员 3、7、8、11(MMP 3、7、8、11)和金属蛋白酶抑制体 (TIMP) 1。多数致炎基因包括TNF α、白细胞介素 (IL)     

基质金属蛋白酶-3与强直性脊柱炎疾病活动相关性研究

目的本试验拟通过检测强直性脊柱炎(AS)患者血清和关节液中基质金属蛋白酶(MMP)-3的表达水平及分析其与AS病人疾病活动的相关性来确证和探讨MMP-3在AS发病中的作用。方法应用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测两组AS患者血清中MMP-3的表达水平,一组是41例未用任何抗肿瘤坏死因子(TNF)-琢等生物制剂治疗的AS患者血清,另一组是13例应用抗TNF-琢单克隆抗体Infliximab治疗前和治疗14周后的AS患者血清,同时对比检测了28名正常对照个体血清和8例AS患者关节液中MMP-3的水平。结果AS患者关节液中MMP-3水平显著高于AS患者外周血水平(P<0.00001);41例未用任何生物制剂治疗的AS患者,其血清MMP-3的水平与AS疾病活动指数(BASDAI)(r=0.48,P=0.0007)和血沉(ESR)(r=0.54,P=0.0001)具有明显相关性;同时应用对数相关分析发现根据BASDAI值判别的病情活动度与ESR(P=0.025)和MMP-3(P=0.04)水平之间亦具有高度相关性。应用Infliximab治疗14周后,AS患者血清MMP-3水平和BASDAI值比治疗前显著下降(P=0.013和P=0.00007)。结论AS患者血清中MMP-3水平可作为评价AS疾病活动性潜在的生物学标志物。此外,由于MMP-3在关节和外周血中均有稳定水平的表达,因此MMP-3还是研究AS发病机制的肯定和有用候选基因。     

反应性关节炎患者关节液T细胞克隆研究

目的比较来自反应性关节炎(ReA)患者的关节液的CD8^ T细胞克隆、CD4^ T细胞克隆和γδ^ T细胞克隆的细胞因子表达谱，探讨ReA的免疫机制。方法用含56种细胞因子基因的cDNA微阵列筛选来自3个ReA患者的关节液的3个CD8^ T细胞克隆、3个CD4^ T细胞克隆和3个γδ^ T细胞克隆的差异表达基因。结果微阵列研究显示，CD8^ 和CD4^ T细胞克隆中有编码干扰素(IFN)-γ和肿瘤坏死因子(TNF)-α转录物的表达。15个微阵列试验中有14个可以用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术证实有这些细胞因子的表达。CD4^ 细胞持续表达淋巴毒素-α(LT-α)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM—CSF)。但是γδ^ T细胞主要表达转化生长因子(TGF)-β2和GM—CSF。结论CD8^ 和CD4^ T细胞克隆的细胞因子表达谱主要为Th1，而γδ^ T细胞较少表达促炎症细胞因子，似为Th3模式。ReA患者关节液的T淋巴细胞克隆显示了不同的细胞因子表达谱，它反映了不同的T细胞在发病机制中有不同的作用。     

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IL-8在强直性脊柱炎活动期的表达与意义

目的 探讨趋化因子IL-8在强直性脊柱炎(AS)活动期的表达及意义。方法 通过cDNA微阵列及RT-PCR技术检测活动期AS患者和对照组[健康志愿者、类风湿关节炎(RA)及膝关节外伤患者]的外周血、关节液中单个核细胞和滑膜细胞IL-8的表达．比较AS患者组与各对照组IL-8表达情况的差异。结果 在活动期AS患者外周血单个核细胞(PBMC)或关节液单个核细胞(SFMC)中IL-8的表达均明显高于健康志愿者PBMC中的表达，在RA患者PBMC中IL-8的表达亦高于健康志愿者PBMC中的表达．关节滑膜细胞IL-8的表达水平在AS患者也明显高于膝关节外伤患者。结论 IL-8在活动期AS中存在高表达，可能是AS的一种重要的炎症介质，介导AS滑膜甚至其他受累组织炎症的发生和发展。     

未折叠蛋白应答在强直性脊柱炎发病机制中的意义探讨

目的:通过研究强直性脊柱炎(AS)病人的外周血单个核细胞(PBMC)关节液单个核细胞(SFMC)的基因谱,了解有无支持UPR假说的转录物以及那些细胞参与未折叠蛋白应答(UPR),UPR在AS病人的变化及其在关节炎发病机制中的作用和意义。方法:AS病人的PBMCSFMC基因表达谱通过含1176基因的cDNA微阵列扫描得到,结果中比较AS与健康自愿者和RA病人有差异表达的基因C2、C3、C8、LMP2、LMP7和BiP(UPR的标志物)再以RTPCR验证。结果:AS患者的SFMC中的BiP表达显著高于RA患者SFMC组(RTPCR的均数和标准差为86.4±111.3和18.5±13.0,两者比较,P=0.044),AS和RA患者SFMC组的C2分别为91.6±36.7和18.5±3.6(两者比较,P<0.037),而且AS患者的SFMC中BiP和UPR相关的蛋白酶体C2的增高水平密切相关(相关系数r=0.9)。另外,研究还发现,AS患者SFMC过度表达BiP的细胞是单核巨噬细胞。结论:内质网UPR确实发生在AS患者SFMC中的巨噬细胞。结果显示UPR应答在AS病人关节炎症的初期和延续中起重要的作用。     

人白细胞相关抗原B27及细菌多肽在脊柱关节病发病中的作用

目的了解细菌多肽应具备什么基本条件才能被人白细胞相关抗原（ＨＬＡ）Ｂ２７递呈而导致脊柱关节病。方法以来自衣原体热休克蛋白６０、能与Ｂ２７分子结合的９肽作为原型，用人工方法将９肽的每一个氨基酸残基均以另外１９种氨基酸替换，将合成的１８０种９肽分别与Ｂ２７Ｔ２细胞孵育，观察其与抗Ｂ２７单克隆抗体Ｂ２７Ｍ２的反应性。结果与Ｂ２７分子结合的９肽其第２位氨基酸残基应是精氨酸，以其它１９种氨基酸替换均使Ｂ２７Ｍ２的反应性明显降低；第６，８，９位氨基酸残基的选择性亦较高，仅有６～８种氨基酸能诱导与Ｂ２７Ｍ２的反应性；第３，５，７位氨基酸残基没有什么选择性，几乎任何一种氨基酸残基对Ｂ２７Ｍ２反应性的影响均不大。结论第２，９位氨基酸残基是９肽与Ｂ２７紧密结合所必需的，而第６，８位氨基酸可能与抗Ｂ２７单克隆抗体的识别有密切关系     

膜表面型与可溶型HLA-B27 分子在人C1R细胞内的细胞生物学研究

目的 :了解两型HLA B2 7分子在人细胞系内的合成、组装及转运过程。方法 :克隆到真核表达载体RSV 5neo的膜表面型与可溶型B2 7(sB2 7)cDNA以电转法转入人B淋巴母细胞突变细胞系C1R ,并使其稳定表达。以免疫沉淀、脉冲追踪及内切糖苷酶H消化实验观察两型B2 7分子在C1R细胞系内的细胞生物学特点。结果 :sB2 7分子与膜表面型B2 7分子一样 ,约需 30min完成细胞内的修饰过程 ,均与Calnexin及BiP这两种分子伴侣相关等 ,但与膜表面型B2 7分子相比 ,仅部分sB2 7分子被转运到细胞表面 ,相当一部分sB2 7分子 4h后仍滞留在内质网腔内。结论 :sB2 7分子在人C1R细胞内的合成、组装与转运过程与膜表面型B2 7分子相似 ,滞留在内质网腔的sB2 7分子的酶解片段有可能通过Ⅱ类分子而递呈给CD4 T细胞 ,这一现象将为研究HLA Ⅱ类分子与脊柱关节病的相关提供新线索 ,并为今后探讨B2 7及环境因素与脊柱关节病的相关、寻找早期诊断与早期治疗措施提供理论依据     

cDNA芯片技术在强直性脊柱炎研究中的初步应用

目的 了解强直性脊柱炎（AS）病人外周血单个核细胞（PBMC）基因表达谱与类风湿关节炎（RA）及健康志愿者有无差异,寻找疾病发生及炎症相关的异常变化基因,初步探讨其变化意义。方法 以含588个基因的cDNA微阵列检测7例活动期AS、6例活动期RA病人以及7位正常对照者PBMC基因表达谱,并挑选至少有4例关节炎病人表达增多的13个炎症反应相关的细胞因子,扩大研究病例数以半定量逆转录聚合酶链（RT－PCR）方法验证其表达水平。结果 cDNA微阵列检测结果显示,AS和RA病人基因表达谱明显异常。在正常对照组、AS和RA病人的异常高表达的基因表达率分别为8．4％、32．5％和44．8％,两组关节炎病人与正常对照者比较P均＜0．001;而且RA组异常表达率又明显多于AS组（P＜0．012）,2例活动性肺结核病人也有类似的高表达。以RT－PCR法验证的13个基因的表达水平,发现22例AS,8例RA病人基因表达结果与cDNA微阵列检测结果一致。结论 AS病人PBMC基因表达谱明显异常,与RA病人也明显不同,13个细胞因子的高表达对AS无特异性。     

南蛇藤素和扁蒴藤素显著下调HLA-B*2705启动子的活性

目的： 利用高通量药物筛选方式,为寻找潜在的脊柱关节炎（SpA）新的治疗药物提供理论依据。方法: 选取12 264小分子化合物分别使用293T-HLA-B27和 HeLa- HLA-B27稳定细胞株,观察对HLA- B*2705启动子有调节作用的化合物,筛选能够下调HLA-B*2705启动子活性的阳性化合物：启动子活性>150%为激动剂,启动子活性<60％为抑制剂。并且对进一步筛选出的抑制剂进行细胞毒性试验及半数抑制浓度/半数效应浓度（IC50/ EC50）检测,筛选出具有较好剂量－效应的阳性化合物。结果：(1)使用293T-HLA-B27细胞第1次筛选出624种阳性化合物,阳性率为5.1%; (2)使用HeLa-HLA-B27细胞株对上述624种化合物进行再次筛选,有70种化合物再次显示出对B*2705启动子活性的增强或者抑制作用;(3)进行EC50/IC50检测的40种化合物中,6种化合物为抑制剂,表现出较好的剂量－效应曲线,其中南蛇藤素和扁蒴藤素均为雷公藤类衍生物。结论：南蛇藤素和扁蒴藤素可下调HLA-B27表达, 提示在今后针对HLA-B*2705相关的SpA患者治疗中, 它们可能是值得研究的潜在有效化合物。