安定对大鼠脊髓损伤后细胞凋亡的影响

目的:探讨安定对大鼠挤压伤模型脊髓损伤后的作用,以及γ-氨基丁酸A型受体拮抗剂荷包牡丹碱和苯二氮受体拮抗剂氟马西尼对此作用的影响。方法:实验于2003-04/2004-11在解放军第四军医大学神经科学研究所完成。选择SD雄性大鼠36只,体质量180～200g,随机分为6组,每组6只。大鼠脊髓挤压伤模型建立后立即给药,对照组给予生理盐水2mL/kg腹腔注射;安定组给予安定10mg/kg腹腔注射;安定+荷包牡丹碱组同时给予安定10mg/kg及荷包牡丹碱2.1mg/kg;安定+氟马西尼组同时给予安定10mg/kg及氟马西尼5mg/kg;荷包牡丹碱组仅给予荷包牡丹碱腹腔注射2.1mg/kg;氟马西尼组给予氟马西尼5mg/kg。药物作用72h后采用脊髓原位末端标记法观察各组大鼠凋亡细胞分布情况,并比较每张切片平均凋亡细胞数。结果:36只大鼠全部进入结果分析。平均每张切片凋亡细胞数:安定组明显小于对照组犤(69.15±14.25)个,(130.08±30.40)个,卓艹(t=4.4457,P<0.01)犦;安定+荷包牡丹碱组及安定+氟马西尼组犤(89.75±14.45)个,(97.76±14.85)个犦均明显大于安定组(t=2.4868,3.4051,P<0.01),但小于对照组(t=2.93522.3399,P<0.01),而此两组结果比较差异无显著性意义(P>0.05)。荷包牡丹碱组及氟马西尼组犤(137.38±29.11)个,(131.53±28.68)个犦与对照组比较差     

β-七叶皂苷早期应用对大鼠脊髓损伤的保护作用

目的:观察β-七叶皂苷(β-aescin)对大鼠脊髓损伤后继发性损害的保护作用。方法:本实验采用NYUⅡ型脊髓撞击伤仪制成中度脊髓损伤模型。术后30 min,所有大鼠分别经腹腔给予β-七叶皂苷(1.0 mg/kg)或盐水治疗,3次/d,连给3 d。术后,于各时间点采用BBB评分和足迹实验对大鼠双后肢运动功能进行评估;术后24 h,对损伤部位脊髓组织丙二醛(MDA)含量及髓过氧化物酶(MPO)活性进行检测;术后14 d行免疫组织化学检查,利用胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)观察损伤星形胶质瘢痕及其包围的坏死空洞,利用抗CD68/ED1观察活性小胶质细胞和巨噬细胞。结果:β-七叶皂苷组运动功能明显改善(P<0.05);伤后24 h,β-七叶皂苷组大鼠脊髓组织中MDA水平降低67%(P<0.01),MPO活性降低50%(P<0.01);伤后14 d,β-七叶皂苷组空洞面积减小29.3%(P<0.01),ED1染色阳性面积减少32.3%(P<0.01)。结论:β-七叶皂苷治疗可以减轻脊髓损伤后自由基的氧化损伤作用,减小空洞面积,减少炎症细胞的活化和浸润,促进脊髓损伤后的修复。     

小鼠PD-L1胞外段基因的原核表达及活性分析

目的原核表达小鼠程序性死亡分子1配体胞外段(exPD-L1)蛋白基因并在体外初步验证其生物学活性。方法应用小鼠脾脏细胞总RNA,反转录PCR克隆exPD-L1基因序列,将其克隆到pGEX-4T-1载体中构建原核表达载体pGEX-4T-1-exPD-L1,经酶切和测序鉴定正确后,转化到E.coli BL21(D3)中,经IPTG诱导表达后,对包涵体蛋白进行复性和纯化。对表达产物进行SDS-PAGE分析和Western blot法检测证明其正确后,采用GST pull-down检测融合蛋白和PD-1的相互作用,鉴定其生物学活性。结果成功构建重组质粒pGEX-4T-1-exPD-L1,并在宿主菌中成功表达相对分子质量(Mr)55 000的重组蛋白,包涵体成功复性和纯化后经Western blot法证明其正确表达,同程序性死亡分子1(PD-1)蛋白的GST pull-down结果表明融合蛋白具有生物学活性。结论成功克隆和表达小鼠exPD-L1蛋白,并证明其具有生物学活性。     

Shh/Gli1信号参与小鼠脊髓损伤后血-脊髓屏障渗透性改变及运动功能恢复

目的:探讨sonic hedgehog/Gli1(Shh/Gli1)信号在小鼠脊髓损伤后病理变化及运动功能恢复中的作用。方法:成年雄性C57野生型、Gli1lz和Gli1lz/lz小鼠行T8节段脊髓夹伤及假手术。Gli1lz小鼠脊髓损伤及假手术后3 d行X-gal染色;7 d行Shh/PDGFr-α、Shh/GFAP、LacZ/GFAP染色,观察Shh/Gli1信号在小鼠脊髓损伤后的激活。C57野生型和Gli1lz/lz小鼠脊髓夹伤后7 d行GFAP染色和实时定量RT-PCR,观察星形胶质细胞反应;术后14 d尾静脉注射伊文氏兰观察血-脊髓屏障改变;术后1、3、5 d和7 d行BMS评分评价小鼠后肢运动功能。结果:脊髓损伤7 d后,损伤区Shh表达升高;Shh/Gli1信号报告基因LacZ表达升高,主要表达于反应性星形胶质细胞;免疫组织化学及实时定量RT-PCR结果显示Gli1基因敲除不影响脊髓损伤后GFAP表达;伊文氏兰染色及其定量分析显示Gli1lz/lz小鼠脊髓损伤后脊髓组织伊文氏兰外渗增加。BMS评分显示Gli1lz/lz小鼠运动功能恢复显著差于野生型小鼠。结论:Shh/Gli1信号在小鼠脊髓损伤后激活,可能参与脊髓损伤后血-脊髓屏障渗透性的改变,并影响脊髓损伤后的运动功能恢复。     

构建还原论式大鼠脊髓全横断损伤模型的性别影响

目的:建立保留血液供应的大鼠还原论式脊髓全横断损伤模型,探讨性别因素对其实验模型构建和应用的影响。方法:实验于2003-06/2004-12在解放军第四军医大学全军神经科学研究所实验室完成。选择一级SD大鼠90只,雄50只,雌40只,体质量225～250g。分成雄鼠1组40只,雄鼠2组10只,雌鼠组40只,用切割辅以吸除的方法全横断脊髓,保留脊髓腹、背动脉和背静脉,雄鼠2组致伤后即刻处死取材,雄鼠1组和雌鼠组观察6周后处死取材。雄鼠2组行苏木精-伊红染色观察损伤区脊髓离断情况,雄鼠1组和雌鼠组行苏木精-伊红染色、神经丝和胶质纤维酸性蛋白免疫组织化学染色、生物素化的葡萄糖胺追踪实验观察损伤区脊髓离断情况,行Bas-so-Beattie-Bresnahan(BBB)运动功能评定并记录病死率、压疮发生率。结果:进入BBB运动功能结果分析雄鼠1组和雌鼠组分别为27只和37只大鼠,雄鼠1组脱失13只,雌鼠组脱失3只。①雄鼠2组苏木精-伊红染色显示大鼠脊髓完全横断且保留了脊髓腹、背动脉和背静脉。雄鼠1组和雌鼠组的苏木精-伊红染色、神经丝和胶质纤维酸性蛋白免疫组织化学染色、生物素化的葡萄糖胺追踪实验均显示两组模型损伤区脊髓离断完全,无组织残留,两组间差异无显著性意义(P>0.05);两组BBB运动功能评分结果差异也无显著性意义(P>0.05)。②雄     

芍药甙对体外培养大鼠星形胶质细胞活性的作用

目的　观察中药芍药有效成分芍药甙 (paeoniflorin ,PF)对培养的大脑皮层星形胶质细胞活性的影响。方法　采用体外星形胶质细胞培养的方法 ,对新生SD大鼠 (P2 )大脑星形胶质细胞进行培养 ,7d后纯化 ,再分别进行有血清和无血清培养。以MTT法观察PF对星形胶质细胞活性的影响 ,运用免疫组织化学的方法进行形态学观察。　结果　PF对星形胶质细胞活性有明显的抑制作用 ,不同浓度PF组星形胶质细胞活性均低于对照组 (P <0 0 1) ,并呈现出一定的量效关系 ,这种对星形胶质细胞活性的抑制作用与血清的存在与否无关。　结论　本实验表明芍药甙能抑制星形胶质细胞的活性 ,从而提示PF促进神经细胞活性的作用是一种直接的作用 ,而不是通过胶质细胞间接影响神经细胞     

下丘脑多巴胺能A_(13)细胞群的研究回顾

下丘脑多巴胺能Ａ１３细胞群一直被认为属于间脑内短的投射系统，本文对Ａ１３细胞群的免疫组织化学、纤维投射、生理学和药理学特性及其功能研究进行了详细回顾，认为Ａ１３多巴胺能神经元的活性可能受其它神经递质或调质的调节，可能具有更为广泛的纤维联系和更为重要的功能     

逆转录病毒介导的人CNTF在嗅神经鞘细胞中的表达及其对神经细胞存活和突起生长的影响

目的　研究含有睫状神经营养因子 (CNTF)表达调控系统修饰的嗅神经鞘细胞 (OECs)对神经细胞存活和突起生长的影响。　方法　通过基因克隆 ,用KpnⅠ +XbaⅠ将pcDNA3 S(NGF信号肽 ) hCNTF质粒中含有NGF信号肽的CNTF切下 ,插入逆转录病毒表达载体pRev TRE中。酶切鉴定后 ,将其与本系统的调控质粒pRev Tet On转入Ecopack 2 93细胞进行病毒包装 ,制备重组缺陷型hCNTF和Tet On逆转录病毒感染原代培养的大鼠OECs,用不同浓度的强力霉素诱导 ,以Western blot法对hCNTF的表达培养上清进行检测。将转染hCNTF的OECs与新生 2d大鼠DRG联合培养 ,用其上清培养视网膜节细胞 (RGCs)。经 β tubulin免疫组织化学染色后 ,分别测量DRG神经突起的长度并统计阳性RGCs数目。　结果　 1 经HindⅢ和BamHⅠ酶切鉴定 ,pRev TRE S hCNTF重组体分别被切下 6 30bp和 4 0 0bp片段 ,插入子的方向和完整性经确认与预期相符。 2 以不同浓度强力霉素诱导hCNTF修饰的OECs ,其培养上清均有分子量约 2 4kD的hCNTF蛋白质的显著特异表达 ,此表达与强力霉素的浓度呈正相关。未诱导组和对照组未见明显蛋白带。 3 同单纯OECs(2 3 15± 4 7)、空载 (2 4 5 5± 5 8)、空白 (16 8± 6 5 )等对照组相比 ,经hCNTF转染的OECs上清组的存活RGC数显著