知母总皂苷对脑缺血再灌注损伤的保护机制

目的：评价知母总皂苷对于大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用，观察其对内皮素1及内皮型一氧化氮合酶的影响。方法：实验于2004年在南方医科大学药理学实验室进行，大鼠132只数字表法随机分为5组：①知母总皂苷50，100mg／kg组（n=30）：灌胃相应剂量的知母总皂苷，1次／d，连续7d，7d后线栓法制备急性局灶缺血模型。②己酮可可碱组（n=12，仅进行神经功能评分及脑梗死体积测定）：灌胃45．88mg／（kg&;#183;d）己酮可可碱，连续7d，7d后同前造模。⑧模型组（n=30）：灌胃等量生理盐水7d，7d后同前造模。④假手术组（n=30）：灌胃等量生理盐水7d，7d后手术，但不插线栓塞血管。造模24h观察大鼠神经功能损害并评分，取缺血侧脑组织用TTC染色后比较脑梗死体积，用放射免疫法测定缺血脑组织中内皮素1含量，免疫组织化学法比较脑组织中内皮型一氧化氮合酶阳性表达。结果：87只大鼠进入结果分析。①脑组织梗死体积百分比：知母总皂苷50，100mg／kg组和己酮可可碱组均小于模型组[（21．56&;#177;5．03）％，（23．80&;#177;3．59）％，（18.50&;#177;3．74）％，（28．61&;#177;2．76）％，P〈0．05，0．01]。②神经功能评分：知母总皂苷50，100mg／kg组和己酮可可碱组均低于模型组（P〈0．05，0．01）。⑧脑组织内皮素1含量：模型组显著高于对照组[（0．68&;#177;0．19），（0．31&;#177;0．11）ng／g，P〈0．01]；知母总皂苷50，100mg／kg组均低于模型组[（0．43&;#177;0．06），（0．36&;#177;0．20）ng／g，P〈0．05，0．011，但2组间比较差异无显著性意义。④内皮型一氧化氮合酶阳性表达：知母总皂苷50，100mg／kg组阳性细胞数增多、表达强度增强。结论：知母总皂苷对于脑缺血再灌注后引起的脑损伤具有确定的保护作用，其保护机制可能涉及减少内皮素1的释放、增强内皮型一氧化氦合酶表达、改善缺血脑组织中血管内皮功能及血供有关。     

白藜芦醇苷对全脑缺血再灌注大鼠脑保护的剂量依赖性作用

目的:观察白藜芦醇苷注射液对大鼠全脑缺血再灌注损伤脑保护作用的剂量依赖性关系,并以己酮可可碱作阳性对照。方法:实验于2004-06在南方医科大学基础部药理教研室完成。选择SD大鼠132只,随机分6组:假手术组、模型组、白藜芦醇苷注射液7.5,15,30mg/kg组,己酮可可碱16.5mg/kg组,每组22只。各药物组均舌下静脉给药,1次/d,连续2d,假手术组和模型组给予生理盐水注射液5mL/kg。给药第3天,将各组大鼠腹腔注射麻醉,动脉夹结扎双侧颈总动脉,缺血1h后经舌下静脉再注射各剂量药物或生理盐水,继续缺血1h后解除动脉夹实施再灌注,缝合切口。假手术组除不结扎外,其余步骤同上。于再灌注24h时各组取12只测定脑组织超氧化物歧化酶活性和丙二醛含量评估脂质过氧化和氧自由基水平,各组取10只大鼠测量脑组织含水量评估脑水肿情况。结果:132只大鼠全部进入结果分析。①各组大鼠脑组织超氧化物歧化酶活性和丙二醛含量:模型组脑组织超氧化物歧化酶活性明显低于假手术组犤(1390.3±76.2),(1853.7±64.0)μkat/g犦,丙二醛含量高于假手术组犤(92.33±13.05),(65.76±8.56)μmol/g,(P<0.01)犦,白藜芦醇苷注射液各剂量组均能明显升高脑组织中超氧化物歧化酶活性犤(1620.3±68.2),(1793.7±99.4),(2023.8±89.2)μkat/g犦,降低丙二醛含量犤(87.4±4.33),(70.1±2.35),(66.3±2.81)μmol/g,(P<0.01)犦,且呈剂量依赖趋势。②各组大鼠脑组织含水量:模型组大鼠大脑右半球含水量明显高于假手术组及己酮可可碱16.5mg/kg组、白藜芦醇苷注射液7.5,15,30mg/kg组犤(79.32±0.65)%,(77.36±1.33)%,(78.69±0.64)%,(78.54±1.32)%,(78.12±1.29)%,(77.63±0.99)%,(P<0.01)犦。各给药组大鼠大脑右半球含水量亦较假手术组低,同时有呈剂量依赖性的趋势(P<0.05～0.01)。结论:白藜芦醇苷注射液能显著减轻脑缺血再灌注损伤引起的氧自由基损害,减少过氧化脂质的形成,并且可以减轻脑水肿,从而改善脑组织微循环及缺血、缺氧,作用强度有剂量依赖关系,以白藜芦醇苷注射液30mg/kg组治疗效果最好。     

血管紧张素Ⅱ1型受体阻断剂预处理对小鼠动脉硬化后局灶性脑缺血再灌注脑损伤的影响血管紧张素Ⅱ1型受体阻断剂预处理对小鼠动脉硬化后局灶性脑缺血再灌注脑损伤的影响

目的：探讨阻断血管紧张素Ⅱ1型受体对动脉粥样硬化小鼠脑缺血再灌注损伤的影响。方法：实验于2003-09／2004-12在南方医科大学中心实验室完成。选择载脂蛋白E基因敲除小鼠40只，随机分为对照组（n=20）：高胆固醇食物喂养10周，替米沙坦预处理组（n=20）：高胆固醇食物饲喂8周后替咪沙坦0．3mg／（kg&;#183;d）拌入食物中连续饲喂2周。喂养10周后同时建立缺血／再灌注脑损伤模型，缺血1h，再灌注23h。行相关指标的测定：用尾袖法测量血压；图像分析系统计算梗死面积百分比；计算两组动物死亡率；神经功能损害评分如下：0分为无神经功能损害体征，1分为右前爪肌力减弱，2分为躯体向左侧弯曲，3分为向左侧作旋转运动，4分为无自主运动；行脑组织含水量测定；在荧光显微镜下观察超氧化物阴离子的产生情况。结果：剔除实验结束前死亡动物，对照组死亡5只，替咪沙坦预处理组死亡4只。对照组15只和替咪沙坦处理组16只计入结果。①替咪沙坦预处理对动物血压的影响：与对照组比较，缺血前、后及再灌注后替咪沙坦预处理对动物血压无明显影响[（101&;#177;3），（105&;#177;5）mmHg；（87&;#177;6），（88&;#177;3）mmHg；（93&;#177;5），（94&;#177;6）mmHg，P〉0．05]。②替咪沙坦预处理对梗死面积的影响：缺血／再灌注损伤后可见恒定的白色梗死灶，与对照组相比，替咪沙坦预处理组梗死面积减小，差异显著（P〈0．05）。③替咪沙坦预处理对动物死亡率、神经功能缺陷评分和脑组织含水量的影响：与对照组相比，替咪沙坦预处理能降低动物死亡率及神经功能缺陷评分和脑含水量[46．67％，31．13％；2．75&;#177;0．20，2．00&;#177;0．30；（83．29&;#177;0．45）％，（80．17&;#177;0．32）％，P〈0．05]。④替咪沙坦预处理对脑血流的影响：中脑动脉梗死后，梗死灶中心区脑血流均降至基线值20％以下，再灌注后预处理组脑血流高于对照组（P〈0．05）。而梗死灶半暗区脑血流均降至基线值50％以下，梗死后30min至再灌注后，预处理组脑血流高于对照组（P〈0．05）。⑤替咪沙坦预处理对氧应激的影响：梗死灶活性氧的产生增加，替咪沙坦预处理组活性氧的产生不明显。替咪沙坦预处理组还原型辅酶Ⅱ的活性较对照组明显减低[（0．512&;#177;0．030），（0．782&;#177;0．032）mkat／g，P〈0．05]。结论：预先阻断血管紧张素Ⅱ1型受体可以缩小动脉粥样硬化小鼠脑缺血再灌注损伤的梗死面积，降低脑水肿和动物死亡率，改善神经功能缺失体征，抑制超氧化物阴离子的产生和还原型辅酶Ⅱ氧化酶活性增加，从而减轻了脑损害的程度。     

成年大鼠弥漫性脑损伤后海马齿状回神经前体细胞增殖的NOS-NO通路机制研究

目的　观察NO前体及选择性NOS干预剂对弥漫性脑损伤后齿状回神经发生的调控作用 ,探讨NOS -NO通路在成年脑神经发生中的角色。方法　选用成年弥漫性脑损伤大鼠模型 ,采用BrdU标记分裂细胞及免疫组织化学方法比较弥漫性脑损伤后 2、4、6、8、12d时各干预剂干预组大鼠与相应对照组大鼠之间海马齿状回神经前体细胞的增殖速度。结果　L -精氨酸 (L -Arg) 2 0 0mg/kgi.p .后 ,成年大鼠弥漫性脑损伤后各个时间点海马齿状回BrdU免疫阳性细胞数目均显著增多 ,以脑损伤后 6d和 8d时增加最为明显 (P <0 0 1)。 7-硝基引唑 (7-NI) 5 0mg/kgi.p .后 ,明显抑制了大鼠弥漫性脑损伤后不同时间点齿状回细胞增殖 ,在弥漫性脑损伤后 4d时抑制作用相对最为明显 (P <0 0 1)。氨基胍 (AG) 10 0mg/kgi.p .后 ,也明显减少了大鼠弥漫性脑损伤后不同时间点齿状回BrdU免疫阳性细胞数目 ,从第 8天后抑制作用相对更为明显 (P <0 0 1)。结论　弥漫性脑损伤后激活的NOS -NO通路是海马齿状回神经发生过程中一个重要的调控通路 ,不同来源的NO分别在弥漫性脑损伤后不同时间齿状回神经发生中发挥作用。     

环磷酸腺苷和一氧化氮在后适应保护缺氧/复氧损伤心肌细胞中的作用

背景：周期性的环磷酸腺苷浓度改变参与了预适应对缺血心脏的保护作用。 目的：观察环磷酸腺苷和一氧化氮在缺氧/复氧心肌细胞后适应保护机制中的可能作用。 方法：原代培养SD乳鼠心肌细胞,随机分为11组分别处理：正常对照组、缺氧/复氧组、心肌缺血后适应组、心肌缺血后适应+咯利普兰组、心肌缺血后适应+SQ22536或左旋精氨酸+心肌缺血后适应组,咯利普兰、SQ22536或各浓度Nω-硝基精氨酸+缺氧/复氧组。 结果与结论：心肌缺血后适应能显著改善缺氧/复氧损伤造成的心肌细胞活力下降,减少乳酸脱氢酶、肌酸激酶的释放,降低一氧化氮、肿瘤坏死因子α和白细胞介素β的mRNA表达;咯利普兰能进一步增强后适应对心肌细胞的保护作用,而腺苷酸环化酶抑制剂SQ22536可显著减弱该作用;20,100 μmol/L 非选择性一氧化氮合酶抑制剂Nω-硝基-左旋精氨酸能发挥类似于后适应的保护作用,而在1 000 μmol/L时则损伤心肌细胞(P < 0.05)。证实心肌缺血后适应对缺氧/复氧损伤心肌细胞的保护,可能是通过增强环磷酸腺苷信号抑制炎症过程实现的。     

PDE4抑制剂FCPR16对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠的保护作用

目的：研究PDE4抑制剂FCPR16对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠的作用及可能的机制。方法：采用线栓法在SD大鼠中建立大脑中动脉阻塞（MCAO）模型,缺血2 h后,大鼠腹腔注射2.5、5、10 mg/kg FCPR16,再灌注24 h。按照Zea-Longa评分表进行神经功能行为评分;进行TTC染色,测定FCPR16对MCAO模型大鼠脑梗死面积的影响;利用HE染色观察脑组织的形态学改变;利用ELISA方法和Western bolt法检测血清和脑组织中炎症因子的含量;检测脑组织Iba-1和GFAP的表达情况;TUNEL染色检测神经细胞凋亡情况,Western bolt法检测凋亡相关蛋白的变化;测定脑组织中cAMP的含量,以及CREB、p-CRRB的表达情况。结果：FCPR16呈剂量依赖性地改善MCAO大鼠的神经功能症状,减少脑梗死面积,减轻脑组织的病理性变化;FCPR16能降低MCAO大鼠血清和脑组织中炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β的含量;免疫荧光和Western bolt结果表明FCPR16减弱MCAO大鼠缺血脑组织中GFAP和Iba-1的表达水平;TUNEL染色发现FCPR16减少MCAO大鼠的神经细胞凋亡,Western bolt结果显示FCPR16减少Caspase-3的含量,增加Bcl-2/Bax的比值和磷酸化Akt蛋白水平;FCPR16增加了MCAO大鼠脑组织中cAMP的含量以及磷酸化CRRB的表达水平。结论：FCPR16能改善MCAO大鼠的神经功能症状,减少脑梗死面积,改善脑组织病理性变化。其机制可能与减少炎症因子含量,抑制小胶质细胞和星形胶质细胞的激活,减少神经细胞的凋亡,激活cAMP/CREB路通有关。     

Tideglusib 对MPP+ 诱导的SH-SY5Y 细胞凋亡的保护作用及其机制研究

目的：研究特异性GSK-3β抑制剂Tideglusib 对1- 甲基-4- 苯基- 吡啶离子（1-methyl-4- phenylpyridinium ion,MPP+）诱导SH-SY5Y 神经细胞凋亡的保护作用及其可能的作用机制。方法：通过MPP+ 诱导SH-SY5Y 细胞凋亡建立体外帕金森病细胞模型,采用MTT 筛选出对SHSY5Y起保护作用的Tideglusib 有效浓度;采用免疫化学染色方法检测Tideglusib 对SH-SY5Y 的神经保护作用;分别采用Hoechst33258 核染方法和流式细胞仪检测Tideglusib 的抗凋亡作用;通过Western-blot 检测经Tideglusib 处理后,SH-SY5Y 细胞中与神经元凋亡密切相关的磷酸化 tau蛋白（p-tau）及其上游激酶磷酸化糖原合成激酶（p-GSK-3β）的表达水平。结果：300 μmol·L-1 的MPP+ 处理SH-SY5Y 细胞48 h 构建体外帕金森细胞模型,通过MTT 及免疫化学染色方法筛选Tideglusib 的有效保护浓度发现5 μmol·L-1 的Tideglusib 可对SH-5Y 细胞产生保护作用,细胞存活率与MPP+ 处理组相比差异具有统计学意义（P<0.01）;通过Hoechst33258 和流式细胞仪发现MPP+ 可导致SH-SY5Y 产生凋亡,5 μmol·L-1 的Tideglusib 可有效改善SH-SY5Y 的凋亡情况,差异具有统计学意义（P<0.01）;Western-blot 结果显示MPP+ 可引起 GSK-3β的活化并诱导 tau 的异常磷酸化;而Tideglusib 可下调 GSK-3β的活性,降低磷酸化 tau 的水平（P<0.05）。结论：Tideglusib可抑制MPP+ 引起的SH-SY5Y 神经细胞凋亡,作用机制可能是通过抑制GSK-3β从而降低tau 蛋白的磷酸化水平,进一步发挥神经元保护作用。     

二甲双胍改善高脂饮食诱导的大鼠学习记忆障碍

目的探讨二甲双胍（metformin,MET）对高脂饮食诱导的大鼠学习记忆障碍的影响。方法30只sD大鼠,随机分为普通饲料饲养组（Control组）和2个高脂饲料饲养组（highfatdiet,HFD）,共4周,后2组中又分为仅用HFD组及HFD＋MET组。MET浓度为2ms／ml,连续给药4周后尾尖取血检测大鼠空腹血糖及糖耐量,并测定大鼠焦虑样行为和学习记忆的变化,方法包括高架十字迷宫实验、敞箱实验、水迷宫实验、被动回避实验。结果HFD导致大鼠糖耐量降低,而MET处理可以改善大鼠糖耐量;HFD与HFD＋MET处理不影响大鼠的自主活动性,也不诱导大鼠出现焦虑样症状;在水迷宫实验的探索阶段,相对于HFD组,MET＋MET组大鼠穿越平台次数显著增加,第1次到达平台时间缩短,在目标象限探索时间缩短;在被动回避实验中,其逃避潜伏期较HFD组显著延长,进入暗箱次数减少。结论MET对高脂饮食诱导的学习记忆障碍有一定的改善作用。     

知母皂苷元对痴呆模型大鼠的影响

目的 建立大鼠β-淀粉样肽[Aβ(25-35)]诱导的痴呆模型,探讨知母总皂苷在阿耳茨海默病(AD)发病机制中的作用。方法 SD大鼠60只,采用脑立体定位技术在大鼠单侧侧脑室一次性注射老化的Aβ(25-35)建立实验性AD模型。手术24h后,大鼠经灌胃分别给予3种剂量的知母总皂苷和EGB761,模型组和空白组给予等剂量的蒸馏水,1次/1d,连续14d。在给予Aβ(25-35)后的第8天,应用Morris水迷宫法测定大鼠的学习记忆功能,造模后第14天断头取脑,测定脑组织超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和总抗氧化能力。结果 与空白对照组相比,模型组大鼠空间学习记忆能力明显减弱,寻找平台潜伏期明显延长(P<0.01);脑组织SOD、总抗氧化能力明显降低(P<0.01),而MDA明显升高(P<0.05)。与模型组比较,给予知母总皂苷治疗后的大鼠学习记忆功能障碍得到明显改善,潜伏期显著缩短(P<0.05),SOD活力显著提高(P<0.05),总抗氧化能力也显著增强(P<0.05),MDA水平明显降低(P<0.05)。结论 知母总皂苷可明显改善AD模型大鼠的学习记忆功能,同时可提高模型大鼠的抗过氧化能力,这有可能是其改善学习记忆的原因之一。     

靶向hVEGF165基因shRNA质粒表达载体的构建及筛选

目的 构建编码hVEGF165 mRNA的shRNA质粒表达载体,并筛选出基因沉默效果最明显的shRNA质粒表达载体.方法 以hVEGF165 mRNA编码区中第5和第7外显子序列作为RNA干扰靶点,分别构建3个shRNA质粒表达载体和1个阴性对照质粒表达载体并通过PCR进行鉴定.经鉴定后分别转染稳定表达hVEGF165基因的BHK细胞,实时荧光定量PCR和Western blotting分别从mRNA和蛋白质水平检测抑制效果.结果 构建的质粒表达载体PCR鉴定均可扩增出预期条带,构建成功.靶向hVEGF165基因的shRNA对所转染稳定表达hVEGF165基因的BHK细胞中hVEGF165基因mRNA和蛋白质表达均有抑制作用,其中shRNA2最为明显.结论 成功构建了靶向hVEGF165基因的shRNA质粒表达载体,其中抑制效果最为明显的shRNA质粒表达载体为pDC316-EGFP-U6-shRNA2质粒.