乙型肝炎病毒血液核酸筛查进展

确保血液及血液制品的安全,最大限度地降低经血传播病毒的危险,一直是世界各国关注的问题。随着检测技术的不断进步,输血传播相关病毒的危险性已大大降低,但由于病毒感染者“窗口期”献血、病毒变异、低病毒载量感染等因素,使得临床输血安全依然存在一定风险。核酸扩增技术(NAT)可直接检测病毒核酸,能大大缩短病毒“窗口期”,极大提高血液的安全性,已在国内外广泛应用于血液常规筛查。1 NAT在血液HBV DNA筛查中应用的必要性自1971年开始HBsAg作为常规筛查项目引入到血液筛查中,使得输血后感染乙肝的发生率大大降低,目前酶免疫检测(EL…     

免疫筛查阴性献血者血样病毒核酸检测的研究

目的了解二次酶联免疫筛查献血者血样漏检的原因。方法将二次酶联免疫筛查阴性的献血者血样在加样仪上实现血液样本汇集,用全自动核酸提取仪提取样本核酸,以核酸扩增检测仪做HBV、HCV和HIV自动扩增检测。对HBsAg阴性、HBVDNA阳性献血者用核酸筛查试剂定量检测HBV,并每隔2周对其跟踪采血,做HBV两对半免疫检测和HBsAgV3的确认试验。结果16320份二次酶联免疫筛查阴性的合格献血者血样中,8份HBVDNA阳性(漏检率0.49‰),未发现HCV和HIV1RNA阳性。8份HBVDNA阳性献血者乙肝两对半免疫检测HBsAg、HBsAb和HBeAg均为阴性,HBcAb均为阳性,3份HBeAb为阳性。6例HBsAg阴性HBVDNA阳性献血者血样的病毒滴度在(76～1490)copies/ml,2例病毒滴度过低,未定量检测到病毒。跟踪6名HBVDNA阳性献血者,1例18周时HBsAg确认试验阳性,其余5例仍为阴性。结论现行的二次酶联免疫技术的血液筛查存在HBV漏检,原因可能是隐匿性乙型肝炎病毒感染。应重视血液筛查工作中HBV的漏检及输血传播,并在现有的血液筛查模式中或增加HBcAb检测,或增加病毒核酸筛查。     

献血者HBV DNA存在的确认与S蛋白变异特征分析

目的对HBsAg阴性和阳性献血者血样HBV DNA存在的确认并分析隐匿性乙型肝炎病毒S区变异特征。方法使用EIA/NAT方法筛查深圳地区19 397份无偿献血者血样,把109例乙肝不合格样品分成3类(HBs Ag+/NAT+、HBs Ag+/NAT-、HBs Ag-/NAT+),通过跟踪检测,确认为OBI毒株10例、HBV窗口期感染期3例和5例缺失追踪的HBs Ag-/HBV DNA+样品,采用荧光定量聚合酶链反应(QPCR)测定HBV病毒载量,应用NestedPCR技术扩增S基因片段并测定序列,与B/C基因型HBs Ag+/HBV DNA+阳性野毒株序列比对。结果深圳市无偿献血者经乙肝表面抗原胶体金快速试纸筛查后的HBs Ag阳性检出率为0.34%(66/19 397);隐匿性乙型肝炎病毒感染(OBI)的流行率范围为1∶1 939-1∶1 293,HBV窗口期感染流行率范围为1∶6 465-1∶2 424;10例OBI样品其病毒载量介于不能定量至112.0 IU/m L(中位数98.5 IU/m L)。10例OBI样本在S蛋白区(nt215-710)出现随机变异,OBI样品S区氨基酸置换率显著高于野毒株(P0.000 1),有4、2、3个OBI样品分别在CTL表位21-29、86-96、172-180出现L21S(2)、K/R24E(1)、I25M(1)、L88P(2)、S172F/L(2)、V178T(1)变异;OBI非CTL表位免疫区的氨基酸置换率亦显著高于野毒株(P0.05);其中1个OBI样品在nt636发生缺失变异。结论深圳献血者OBI流行率有增高趋势,OBI发生机制与乙型肝炎病毒的S蛋白区变异,特别是免疫活性区的变异密切相关。     

血液乙型肝炎核酸筛查质量控制方法的研究

目的研究核酸检测技术(nucleic acid testing,NAT)用于血液乙型肝炎筛查的质量控制方法的建立和应用。方法通过平行测定厂家提供的质控品20份,用即刻法分析其的循环数(x-±2s)和变异系数(CV,%);以质控品循环数在-x±2s范围内为质量控制标准,在同等条件下,检测180份同一批号质控品的循环数,并进行分析。结果实验期间共用3批试剂,更换试剂批号重新即刻法质控。质控品的x-±2s和CV分别为32.1±1.9,5.92%;31.8±2.8,8.8%;31.7±2.6,8.2%。在此质控标准下,检测同一批号质控品180份,177次检测结果在控,3次检测结果失控。室间质评结果与靶值完全一致。结论用定值的质控品控制实验室的乙型肝炎病毒NAT检测结果,可以排除因人员更换等实验条件的差异所导致的误差,使实验室间乙型肝炎病毒NAT结果准确可靠。     

实时荧光PCR检测HBsAg阴性、抗HBc阳性献血者血液中HBV DNA研究

目的对乙型肝炎表面抗原（HBsAg）阴性、乙型肝炎核心抗体（抗HBc）阳性的献血者血液进行经输血传播乙型肝炎病毒（HBV）的风险评估,为完善HBV血液筛查模式及确保临床用血安全提供依据。方法对献血者血液常规检测阴性的标本进行8×45 μL汇集,应用实时荧光聚合酶链反应(PCR)进行混样核酸检测HBV DNA。对血液常规筛查和混样核酸检测合格的标本,进行随机乙型肝炎血清学5项标志物的酶联免疫吸附试验(ELISA)。对获得的HBsAg阴性、混样HBV DNA阴性、抗HBc阳性的标本,进一步采用单份样本（720 μL）实时荧光PCR法检测并定量分析。结果混样标本共检测12 552份,检出HBsAg阴性、HBV DNA阳性标本2份,阳性率为0.02%。随机筛查混样核酸检测阴性标本614份,检出抗HBc阳性标本320份,对此320份标本进行单份核酸检测,检出阳性标本1份,阳性率为0.31%。结论HBsAg阴性、抗HBc阳性献血者血液存在输血传播HBV的风险,应用核酸扩增技术检测血液HBV DNA能大大提高血液安全性。     

核酸检测阳性标本与酶联免疫吸附试验分析研究

目的为了提高临床输血的安全性,拟比较血液筛查核酸检测(NAT)阳性标本结果与酶联免疫吸附试验(ELISA)数据分析,旨在研究探讨如何提高ELSIA检测技术在血液筛查中的灵敏度。方法对55 499例常规ELISA检测非反应性的无偿献血者血样标本,其各项指标均正常的标本,用NAT检测技术8例混合检测,从中比较NAT检测阳性与酶联免疫吸附试验结果。结果血清学检测非反应性标本中11例HBV DNA阳性标本,1例HCV RNA阳性标本,HIV RNA未检出。结论 NAT与ELISA的血液筛查检测互补作用主要体现在3个方面:1)窗口期漏检是目前ELISA漏检的最大因素。2)免疫静默感染、病毒变异、病毒亚型对以抗原-抗体免疫反应技术基础的ELISA方法会降低ELISA检测性能。3)ELISA检测"灰区"的设置在理论上可以减少因试剂检测灵敏度而造成的漏检现象,但仍无法解决因病毒变异、病毒亚型和因"窗口期"而造成的漏检现象。     

核酸扩增技术在献血者血液HBV DNA、HCV RNA及HIV-1 RNA筛查中的应用研究

目的探讨在我国无偿献血者的血液筛查中引进核酸扩增技术(NAT)的必要性,了解献血者血清学病毒标志物检测阴性、NAT检测阳性的感染状况。方法应用Roche PCR、PCR-微流芯片、实时荧光PCR方法对深圳市131 174人(次)血清学检测病毒标志物阴性的献血者进行HBV DNA、HCV RNA和HIV-1 RNA检测,对NAT阳性献血者追踪检测并做定量分析。结果HBV DNA阳性22例,阳性率为1/5 962,其中15例为抗-HBc阳性,阳性率为1/8 745;HCV RNA阳性1例,阳性率1/131 174;HIV-1 RNA未检出阳性。对14名HBV DNA阳性者的追踪发现,8人发生了血清转换现象。结论采用高灵敏度的NAT筛查献血者血液中的HBV和HCV,有助于提高输血及血液安全。     

锁核酸结合分子信标技术检测乙型肝炎病毒DNA G1896A点突变研究

目的研究和评估乙型肝炎病毒(HBV)DNA G1896A点突变的实时荧光PCR检测方法。方法收集经测序验证HBV DNA G1896A未突变的野生型样本150例和已发生突变的突变型样本58例,在突变区域设计分子信标探针,点突变处进行锁核酸处理,利用荧光PCR方法检测HBV前C区G1896A点突变;再从临床标本中随机抽取18例、8例和19例荧光PCR结果分别显示为G1896A突变的标本、杂合的标本以及野生型的标本的PCR产物进行序列测定。结果突变型质粒和野生型质粒的检测灵敏度均可以达到100copies/ml;突变型探针检测高浓度的野生型质粒时无检测信号,野生型探针检测高浓度突变型质粒时无检测信号;突变型模板在总杂合模板中的比例达到5%时则都可以将突变型检测出来;序列测定的8例G1896A突变标本、6例杂合标本和19例野生型标本的PCR产物结果和荧光PCR检测结果完全吻合。结论实时荧光PCR检测方法可以快速、简便、准确地检测HBVDNAG1896A点突变,是检测点突变的重要方法,具有重要的临床应用价值。     

血液混样HCV/HIV-1 RNA全自动提取方法的应用评价

目的：建立献血者全自动核酸检测方法，探讨在我国血液筛查中引进全自动核酸筛查的可行性。方法：选用STAR2000加样仪进行血样汇集(24人份)，在COBAS AMPLICOR进行扩增和检测分析结果，从灵敏度及抗干扰能力方面进行评价。结果：用国际标准核酸质控品考评及常规应用，表明全自动汇集、全自动核酸提取及扩增和检测95％的检出限量HCV RNA和HIV-1 RNA分别为17．4IU／ml和20．6cp／ml，20mg／ml胆红素、1g／dl血色素及中等程度的脂血对结果无影响。通过对16512个样本共688汇集池分析，HCVRNA阳性1例(ELISA亦阳性)，HIV-1 RNA未检出阳性。结论：血液混样MPLC全自动核酸提取方法可应用于血液HCV RNA和HIV-1 RNA的筛查工作。     

建立病毒核酸检测系统追踪抗-HIV ELISA阳性结果

目的 建立病毒核酸检测系统追踪抗-HIV ELISA初筛阳性结果的献血者。方法 献血初次抗-HIV ELISA阳性结果者均进行PA硒标法及ELISA复检，Western Blot确认及病毒核酸检测，对Western Blot结果有条带者，3个月后追踪采血，进行上述检测。结果 81份初次抗-HIV ELISA结果阳性标本，66份复检结果为阴性且无条带，9份复检结果为阳性但无条带，6份Western Blot检测有条带者，3个月后再进行Western Blot检测，结果无条带，上述标本核酸检测结果均为阴性。结论 有必要建立病毒核酸检测系统对抗-HIV ELISA阳性结果进行追踪，以尽可能确保结果的真实性和准确性。