大鼠gp130反义寡核苷酸阻断rhIL-6对大鼠急性髓系白血病细胞系R2体外增殖的抑制效应

IL 6受体 (IL 6R) β链是分子量为 130kD的膜结合糖蛋白 (gp130 ) ,它是介导IL 6生物效应的信号转导子。我们的实验已经证实了重组人IL 6 (rhIL 6 )可作用于大鼠急性髓系白血病细胞系R2 ,rhIL 6与R2细胞表达的hIL 6R结合并与大鼠 gp130缔合而转导IL 6的信号 ,产生其生物效应。本文在体外液体培养中试验观察到 ,大鼠 gp130的反义寡核苷酸片段被摄入R2细胞后 ,对rhIL 6生物效应产生明显的影响。我们的研究结果表明 ,所合成的大鼠gp130反义寡核苷酸片段在细胞体外液体培养中可部分阻断rhIL 6对R2细胞的增殖抑制效应 ,在最适的终浓度 ,其阻断率可达 (45± 7) %。     

适当比例的DNA:脂质体混合物能显著增强DNA疫苗的免疫效果

目的探讨脂质体能否加强DNA疫苗的免疫效果.方法本文应用一系列具有不同比例的编码弓形虫主要表面抗原的质粒DNA脂质体混合物免疫小鼠,并对不同组小鼠的抗体产生情况进行了分析比较.结果不同组小鼠的特异抗体滴度有很大不同,只有一定比例的DNA脂质体混合物才能有效激发体液免疫;适量比例的DNA脂质体混合物能提高特异抗体的滴度、提前特异抗体出现的时间,还能大大降低DNA的用量.本研究尚揭示;一定量的DNA对于有效免疫的激发是必需的,但并不是越多越好.加强注射可以增加免疫反应性,但3次以上似乎没有必要.结论适量比例的DNA脂质体混合物能显著增强DNA疫苗的免疫效果.     

T辅助细胞在疫苗研制中的作用

发展感染性疾病疫苗之关键挑战在于利用确定的抗原以刺激产生能引起保护作用的合适的免疫反应。肽类疫苗的运用得到了极大的关注，其意义在于，已知不同的多表位构成单一结构以诱导出所希望的免疫反应所表现出的灵活性。这一般比利用减毒的活疫苗要安全并且相对而言比制造亚单位疫苗要容易。然而，多肽疫苗的发展面临巨大挑战。这一方法在诱导遗传背景复杂的人群免疫反应方面受到限制，这与主要组织相溶性复合物(MHC)多态性有关。因同样的理由，肽类免疫应答常因缺乏适当的辅助T淋巴细胞(HIL)而引导出不充分的细胞毒素T淋巴细胞(CTL)和抗体反应。另一个运用线性肽链结构的可能缺点是：为了引导出合适抗体反应，表面免疫球蛋白受体簇对于激活静息的B细胞就成为必须因素。由WHC多肽性引起的问题可由运用不加区别的T细胞表位来解决。从麻疹病毒F蛋白(氨基酸288到302)中得到的不加区别的T细胞表位和鼠的确定结合在多种MHC分子上的辅助T细胞表位(v1EB，aa191-209)已被定性并且被用于能极大激发免疫应答的结构中，以克服单一限制型免疫应答的缺陷。合成的，非自然Pan DR表位(PADRE)具有退化的结合几种通常HLA—DR的能力，能以绝对效价和抗体反应质量两种形式来增强激发短肽链的免疫应答。另外，一些所谓的从流感病毒血凝素(HA)来的“不加区别的”T细胞表位，恶性疟疟原虫红细胞前期抗原和分枝杆菌蛋白被报道能激发广泛的免疫应答。为了不加区别地结合于几种同型和同种异型的MHCⅡ类分子，这些肽类应显示出部重叠MHC结合形式或应利用保存于配体中的固定位点和应缺失等位基因特异性固定残基，以防止结合于其它Ⅱ类分子。了解MHCⅡ类分子对肽链的不加区别及特异性识别的生物物理学基础将为在疫苗设计中突破遗传限制的策略提供分子水平的依据。     

日本血吸虫未成熟虫卵可溶性抗原诊断血吸虫病的初步探讨

用日本血吸虫未成熟虫卵可溶性抗原(SIEA)作探针，采用ELISA和ELIB检测血吸虫病人血清抗体，对急慢性血吸虫病人的控出率分别为100％和98．2％，未出现假阳性及交叉阳性反应；治疗后3、6和12个月血清抗体的阴转率分别为32．3％、50．9％和64％。其中抗82，73，67，52，42，38，32，31，28，26．21，18kDa分子的血清抗体消失较快。结果表明，SIEA在血吸虫病的诊断中具有较高的敏感性、特异性和潜在的疗效考核价值。     

紫外线照射前后日本血吸虫尾蚴可溶性虫体蛋白组分的比较

目的利用蛋白质组学技术分离、鉴定日本血吸虫正常尾蚴及紫外线致弱尾蚴虫体间差异表达蛋白。方法分别收集与制备血吸虫正常尾蚴和致弱尾蚴虫体总蛋白,经固相pH梯度双向凝胶电泳分离。凝胶银染并利用ImageMaster2DSoftware5.0凝胶图像分析软件进行比较分析,选取差异表达蛋白点经基质辅助激光解析离子飞行时间质谱仪进行鉴定。结果二维凝胶电泳图像分析结果显示:正常尾蚴和致弱尾蚴各分离出至少1277、1173个清晰、独立的蛋白点,蛋白点匹配率为72.7%,大多数蛋白点相对分子量处于22000～95000范围内,理论等电点为5～8。尾蚴经紫外线致弱前后共发现18个差异表达蛋白,其中5个蛋白于致弱尾蚴中表达消失,12个表达下调,1个表达增强,未见新增表达蛋白。其中13个差异表达蛋白经MALDI-TOF-MS鉴定分析,获悉其肽指纹图谱、理论等电点、分子量及表达水平变化等相关信息。结论利用二维电泳、MALDI-TOF-MS等蛋白质组学技术,共鉴定出13个致弱尾蚴差异表达蛋白,为进一步阐明致弱尾蚴诱导宿主产生高免疫保护力的分子机制提供了实验基础。     

弓形虫SAG1基因在大肠杆菌中的高效表达及重组抗原对弓形虫感染的检测

目的 在原核系统中高效表达弓形虫表面抗原SAG1并利用重组抗原检测弓形虫感染。方法 将截短的SAG1基因经PCR扩增后,定向亚克隆入原核表达载体pET-30a( ),酶切鉴定出阳性重组子并经序列测定证实读码框正确,将重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,以IPTG诱导表达,对融合的表达产物进行纯化和复性,通过免疫印迹和ELISA实验检测其特异的免疫反应性。结果 成功构建截短型SAG1在原核系统中的重组表达质粒,并以融合蛋白的形式在大肠杆菌中得到了高效表达,其表达量占细菌裂解液中总蛋白量的31．58％。经过简易的纯化和复性过程,该重组抗原（rSAG1）能被弓形虫感染的人血清所识别。用rSAG1构建的ELISA试剂盒对弓形虫病的检测具有高度的敏感性和特异性。结论 截短型SAG1在大肠杆菌中得到了高效表达,重组抗原经纯化和复性后,能有效检测弓形虫的感染,可用于构建弓形虫病检测试剂盒。     

日本血吸虫成虫及虫卵可溶性抗原的早期诊断分子筛选

为获取有效的日本血吸虫病早期诊断靶抗原分子。以感染前和感染后2周、4周、6周兔混合血清以及急性、慢性日本血吸虫病人和正常人血清,用Westernblot对日本血吸虫成虫可溶性抗原(AWA)和虫卵可溶性抗原(SEA)进行了全面的分析与筛选。SEA140kDa和AWA54kDa、21kDa、20kDa分子出现最早,能被感染后2周兔血清所识别;SEA69kDa、50kDa、45kDa、38kDa和AWA72kDa、45kDa、34kDa、15kDa相继能被感染后4周兔血清所识别;其中SEA140kDa、50kDa、45kDa、38kDa和AWA34kDa、21kDa、54kDa、15kDa与病人血清反应同6周兔血清反应效果相仿,均为免疫反应主带,且在SDS-PAGE上有对应的蛋白主带,具有潜在的早期诊断价值。进一步对SEA进行抗体类型的分析,发现SEA能刺激机体产生IgG、IgM和IgA反应,其中SEA50kDa、45kDa、38kDa三个抗原分子均能被IgG、IgM、IgA三种抗体所识别,且均为反应主带;SEA140kDa以IgM反应带最深;SEA100kDa反应带仅出现于病人血清,以IgM反应最强,且其与IgM反应带在急性病人血清明显深于慢性病人血清,表明针对IgM的SEA100kDa分子也具有一定的早期诊断和区分病程的价值。SEA140kDa、50kDa、45kDa、38kDa和AWA34kDa、21kDa、54kDa、15kDa和针对IgM的SEA100kDa分子是具有潜在早期诊断价值的优势靶抗原分子。     

弓形虫SAGl基因在大肠杆菌中的高效表达及重组抗原对弓形虫感染的检测

目的在原核系统中高效表达弓形虫表面抗原SAG1并利用重组抗原检测弓形虫感染.方法将截短的SAG1基因经PCR扩增后,定向亚克隆入原核表达载体pET-30a(+),酶切鉴定出阳性重组子并经序列测定证实读码框正确,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),以IPTG诱导表达,对融合的表达产物进行纯化和复性,通过免疫印迹和ELISA实验检测其特异的免疫反应性.结果成功构建截短型SAG1在原核系统中的重组表达质粒,并以融合蛋白的形式在大肠杆菌中得到了高效表达,其表达量占细菌裂解液中总蛋白量的31.58%.经过简易的纯化和复性过程,该重组抗原(rSAG1)能被弓形虫感染的人血清所识别.用rSAG1构建的ELISA试剂盒对弓形虫病的检测具有高度的敏感性和特异性.结论截短型SAG1在大肠杆菌中得到了高效表达,重组抗原经纯化和复性后,能有效检测弓形虫的感染,可用于构建弓形虫病检测试剂盒.     

弓形虫P30基因重组质粒的构建及其免疫效果

目的　通过构建含弓形虫P30不同表达形式 (膜型、分泌型及细胞内型 )的重组质粒 ,并将其用于免疫小鼠 ,测定抗体水平 ,以期初步筛选出一种对弓形虫感染具有良好保护作用的核酸疫苗。　方法　利用PCR技术和亚克隆技术分别构建弓形虫表膜型P30基因重组质粒 (含完整的P30编码序列 ,包括信号肽及疏水尾 )pcDNA3 P30Mb ,分泌型P30基因重组质粒 (含完整的P30编码序列 ,不包括疏水尾 )pcDNA3 P30Se以及细胞内型P30基因重组质粒 (含完整的P30编码序列 ,但不包括信号肽 )pcDNA3 P30In。将以上 3种重组质粒分别与脂质体混合后免疫小鼠 ,ELISA及免疫印迹测定小鼠血清中特异的IgG抗体。　结果　成功构建了弓形虫P30基因 3种表达形式的重组质粒 ,经双酶切鉴定及DNA序列测定 ,3种重组质粒中的插入片段确为P30的编码基因 ,且读码框架正确 ;抗体测定显示 :3个免疫组均能诱导小鼠产生特异的IgG抗体 ,但各组之间IgG出现的时间及强度有一定的差异。　结论　用编码弓形虫P30抗原的重组质粒进行核酸免疫 ,能诱导免疫小鼠产生特异性的IgG抗体 ;膜型及分泌型免疫小鼠的特异IgG抗体出现的时间早于细胞内型免疫鼠 ,但 4wk后 3组间差异无显著性。     

三种表达形式的SAG1基因对小鼠的免疫效果观察

目的 构建了三种表达形式的弓形虫主要表面抗原（SAG1）基因-表膜型,分泌型和细胞内型,并分别用于免疫BALB/C小鼠。结果 SAG1基因免疫小鼠后,表膜型和分泌型较细胞内型体液免疫出现早且反应强;细胞因子水平测试显示免疫后小鼠免疫后应趋向Th1型。攻击感染结果证实;表膜型和分泌型免疫小鼠较细胞内型免疫小鼠所获保护力强。结论 三种表达形式的SAG1基因的小鼠模型中免疫效果不同。