EGFR和PD-L1双靶向嵌合抗原受体构建及表达

目的:构建肿瘤相关抗原表皮生长因子受体特异性嵌合抗原受体(EGFR-CAR)和程序性死亡受体-配体1(PD-L1)抗体双修饰慢病毒载体表达系统。方法:人PD-L1-Fc蛋白免疫BALB/c小鼠,经细胞融合、亚克隆筛选高分泌PD-L1特异性抗体的稳定杂交瘤,酶联免疫吸附试验(ELISA)和Western blot检测抗体特异性,流式细胞术(FACS)鉴定对PD-1配受体封阻性能,Fortebio测定抗体亲和力,抗体全长测序,经保留鼠源CRD1、CRD2和CRD3人源化改造后构建单链抗体(single-chain variable fragment,scFv);人EGFR单克隆抗体杂交瘤系,经5′RACE技术扩增其轻链和重链可变区(VL和VH)基因,构建scFv,克隆至真核载体pcDNA3.1表达鉴定。基因合成EGFR-CAR(引入CD137协同信号胞内功能域)与PD-L1-scFv借助2A序列连接,克隆入慢病毒pLVX-EF1a-IRES-ZsGreen1表达载体,使用Lenti-X Packaging Single Shots (VSV-G)共同转染293T细胞,获得包装病毒,感染293V细胞,FACS测定CAR膜表达,ELISA检测CAR感染293V细胞培养上清中PD-L1-scFv表达情况,转染激活人外周血T细胞,验证CAR膜表达。结果:获得PD-L1抗体11E3,具备高度配受体封阻性能,经人源化改造后,亲和力稳定(2.67×10 -10 mol/L),EGFR-scFv获得有效表达。进一步构建了EGFR-CAR和PD-L1双修饰慢病毒分泌型CAR(CTC0537-1)及膜表达型CAR(CTC0537-2),其病毒感染293V细胞阳性率为10%。CTZ0431-1感染293V细胞后,细胞膜表面表达EGFR-scFv,检测培养上清存在PD-L1-ScFv;CTZ0431-2感染293V细胞后,细胞膜表面EGFR-scFv和PD-L1-scFv有效表达,双表达病毒感染活化T细胞的CAR表达率为39.3%。 结论:成功构建了EGFR-CAR和PD-L1-scFv双表达慢病毒载体,EGFR-CAR中度结合亲和力,此为EGFR靶向和PD-L1抗体双修饰CAR-T细胞的实体瘤治疗研究提供了关键工具。     

制备两种P53重组腺病毒和流式细胞仪定量外源绿荧光蛋白表达

目的P53作为转录因子在细胞应激时呈活化型,调控细胞周期和程序性死亡抑制肿瘤生长,通常,通过各种机制P53呈非活化状态,其中包括P53C-末端负调控序列的作用。该研究目的是制备携带垒长和缺失这些负调控序列P53两种重组腺病毒和用流式细胞仪散点图（Flow cytometry scatter plot,FCM）检测人肺癌细胞外源绿荧光蛋白（Green fluorescence protein,GFP）表达。材料和方法利用pAdEasy-Track载体系统,构建两种P53重组质粒并在细菌中产生重组体,转染L293细胞产生三种重组腺病毒。三种不同浓度病毒分别感染人肺癌801D细胞,FCM分析GFP表达。结果测序证明重组腺病毒：Ad—P53（del）缺失p53C-末端终止密码子前111个碱基和非编码区,Ad—P53（wtp）没有P53碱基缺失。Ad（empty carrier）无P53。FCM scatter plot显示三种病毒感染801D细胞表达GFP百分率接近并随病毒浓度递增。801D包含了不同荧光强度比率的细胞。结论构建和制备了去C-末端P53和全长p53两种重组腺病毒,Ad—p53（del）,Ad-p53（wtp）及空载体Ad-（empty）。流式细胞仪散点图证明该病毒试验系统可靠,可定量外源GFP表达,为病毒感染细胞选择浓度提供准确方法。     

血管内皮细胞生长因子水平对肺癌预后的影响

目的探讨血管内皮细胞生长因子(VEGF)水平对肺癌预后的作用.方法采用ELISA方法对肺癌组(112例)、对照组(48例)、健康组(31例)的血清、尿液及恶性胸腔积液(46例)和结核性胸腔积液(31例)中VEGF水平进行检测,并对其进行分析.结果肺癌组血清VEGF含量[(506.22±365.06)μg/ml]明显高于对照组[(237.16±168.09)μg/ml]和健康组[(131.32±99.76)μg/ml](P＜0.001);血清VEGF的水平与病变侵袭程度、淋巴结转移、远处转移、生存时间密切相关;而与性别、组织学类型无关;恶性胸腔积液中VEGF含量[(937.23±400.92)μg/ml]明显高于结核性胸腔积液组[(257.41±361.47)μg/ml](P＜0.001);肺癌组尿液VEGF水平也明显增高[(167.40±186.89)μg/ml].结论血清VEGF检测可作为临床预测肺癌患者预后的重要指标之一.     

结核分枝杆菌IS6110探针的克隆化

目的　制备克隆化结核分枝杆菌IS6110探针。方法 将IS6110的PCR扩增245bp片段克隆至质粒载体pCR2.1中。结果 得到了含有IS6110克隆化245bp的质粒菌株。结论 克隆化的探针易操作且一致性较好。     

酶联免疫斑点术和流式细胞术检测γ干扰素对结核性胸膜炎的辅助诊断价值

目的 探讨胸腔积液PEMC中CD+4T淋巴细胞分泌或产生IFN-γ的检测对结核性胸膜炎的辅助诊断价值.方法 分离40例结核性胸腔积液(结核组)和30例恶性胸腔积液患者(疾病对照组)PEMC,经克隆表达的早期分泌抗原靶6(ESAT-6)和培养滤液蛋白10(CFP-10)融合蛋白(简称"E/C")刺激后,用ELISpot检测分泌IFN-γ细胞的斑点形成细胞(SFC)数量和流式细胞术(FCM)结合胞内细胞因子染色检测产生IFN-γ细胞比率,并比较这2项指标在结核组和疾病对照组间的差异,同时评价2种方法检测IFN-γ对结核性胸膜炎的辅助诊断效能.结果 PEMC经E/C刺激后用ELISpot检测结核组SFC数量为205(125 ～450)SFC/5×104PEMC,疾病对照组为5(2～18)SFC/5×104PEMC,两组间的差异有统计学意义(U=20.00,P<0.01);FCM检测结核组CD+4T淋巴细胞产生IFN-γ细胞比率为3.27%(1.81%～7.34%),疾病对照组为0.12%(0.06%～0.46%),两组间的差异有统计学意义(U=45.00,P<0.01).ELISpot检测PEMC经E/C刺激后分泌IFN-γ的敏感度为92.5%(37/40)、特异度为80.0%(24/30)、阳性预测值为0.86、阴性预测值为0.89、阳性似然比为4.63和阴性似然比为0.09,准确性为87.1%;FCM检测经E/C刺激后产生IFN-γ的敏感度为87.5%(35/40)、特异度为90.0%(27/30)、阳性预测值为0.92、阴性预测值为0.84、阳性似然比为8.75和阴性似然比为0.14,准确性为88.6%.结论 经E/C刺激后,用FCM和ELISpot检测CD+4T淋巴细胞产生和分泌IFN-γ细胞的方法对结核性胸膜炎诊断的敏感度和特异度高,且对结核性胸膜炎有辅助诊断价值.

Abstract：

Objective To explore the value of IFN-γ produced or secreted by CD+4 T Lymphocytes from pleural effusion mononuclear cells for the diagnosis of tuberculous pleurisy(plTB).Methods The PEMCs of 40 patients with tuberculous pleural effusion and 30 patients with malignancy pleural effusion were selected as the tuberculosis and disease control groups, then co-cultured with the early secretory antigenic target 6 (ESAT-6) and culture filtered protein 10 (CFP-10) fusion protein (E/C).The numbers of spot forming cells(SFC) secreting IFN-γ were enumerated by ELISpot and the ratios of cells producing IFN-γ were detected by flow cytometry and intracellular cytokine staining.Moreover, the two indicators were compared between tuberculosis and disease control groups to evaluate the 2 methods detecting IFN-γ in the diagnosis of plTB.Results After E/C stimulation, the numbers of SFC were 205(125-450)SFC/5×104 PEMC in tuberculosis group and 5(2-18)SFC/5×104 PEMC in disease control group by ELISpot.The difference between two groups was statistically significant (U= 20.00, P<0.01).The proportion of IFN-γ-secreting CD+4 T lymphocytes was 3.27% (1.81%-7.34%) in tuberculosis group and 0.12% (0.06%-0.46%) in control group detected by FCM. The difference between the two groups was statistically significant (U=45.00, P<0.01).The indicators of ELISpot in detection of IFN-γ which was secreted by PEMC after co-cultured with E/C were as follows: sensitivity 92.5% (37/40), specificity 80.0% (24/30), positive predictive value 0.86, negative predictive value 0.89, positive likelihood ratio 4.63, negative likelihood ratio 0.09 and accuracy 87.1%;and for FCM, they were 87.5% (35/40), 90.0% (27/30), 0.92, 0.84, 8.75 and 0.14, respectively and accuracy 88.6%.Conclusion After E/C stimulation, the assay for IFN-γ-secreting CD+4 T lymphocytes by FCM and ELISpot is highly sensitive and specific for diagnosis of plTB as an auxiliary method.     

制备两种p53重组腺病毒和流式细胞仪定量外源绿荧光蛋白表达

背景与目的p53作为转录因子,在细胞应激时呈活化型,可调控细胞周期和程序性死亡抑制肿瘤生长,通常通过各种机制可使p53呈现非活化状态,其中包括p53C-末端负调控序列的作用。本研究旨在制备携带全长和缺失这些负调控序列p53的两种重组腺病毒,并采用流式细胞仪散点图(flow cytometry scatter plot,FCM)检测人肺癌细胞外源绿荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)表达。方法利用pAdEasy-Track载体系统,构建两种p53重组质粒并在细菌中产生重组体,转染L293细胞产生三种重组腺病毒,测序证明。三种不同浓度病毒分别感染人肺癌801D细胞,FCM scatter plot检测其GFP表达。结果测序证明重组腺病毒:Ad-p53(del)缺失p53C-末端终止密码子前111个碱基和非编码区,Ad-p53(wtp)无p53碱基缺失。Ad-(empty carrier)无p53。FCM scatter plot显示三种病毒感染801D细胞表达GFP百分率接近并随病毒浓度递增。801D包含了不同荧光强度比率的细胞。结论构建和制备了去C-末端p53和全长p53的两种重组腺病毒:Ad-p53(del)、Ad-p53(wtp)及空载体Ad-(empty carrier)。流式细胞仪散点图证明该病毒试验系统可靠,可定量外源GFP表达为病毒感染细胞选择浓度提供准确方法。     

一种结核杆菌融合抗原的克隆表达及活性测定

目的进一步分析优化结核杆菌抗原优势表位,获得高特异性融合抗原,以满足研制结核病检测试剂的需要。方法用分子生物学软件分析结核杆菌四种抗原MPT64、Mtb8、Mtb8.4和Mtb16.3的优势表位后,分别插入到pBVIL1载体中,构建表达质粒,并利用pBVIL1载体特点,将其基因连接后,进行融合表达,经纯化获得抗原,用间接ELISA法测其活性。结果各抗原优势肽段及融合抗原均获得了高效表达,融合抗原的特异性和灵敏性均高于各单一肽段。结论此融合抗原可用于研制结核病的诊断试剂。     

天然调节T细胞与结核病免疫病理关联

目的 检测调节性T细胞(Tr)在结核病病人是否增高,确证Tr与结核免疫病理的关联性,为Tr功能研究提供疾病模型.方法 流式细胞术(FACS)分选CD3+CD4+T及CD3+CD8+T等主要淋巴细胞亚群,通过RT-PCR测定Foxp3基因在正常和结核病病人T细胞亚群中的表达,FACS多色分析Foxp3 T细胞在CD4+CD25+细胞群体中的分布,累积病例分析Tr细胞在外周血扩增情况,免疫组化方法分析Tr在结核病理的浸润,结合临床资料分析Tr数量的改变与结核病的关联性.结果 Foxp3基因在正常和结核病病人CD3+ CD4+T细胞中特异性扩增,FACS分析表明foxp3主要表达于CD4+ CD25high亚群中,占CD4+ CD25highT细胞的80%以上,以CD4+CD2high Foxp3+三联标志检测40例正常与51例活动性结核病病人外周血Tr占CD4+T细胞比例分别为(0.23±0.20)%和(1.01±1.00)%,结核病病人较正常人高4.4倍,Tr在结核病明显扩增(P<0.01),结核病理组织中有高频率Foxp3+细胞浸润.Tr扩增与结核病有效治疗和预后的关联性有深入探讨价值.结论 Tr细胞在结核病病人增高,并与结核免疫病理损伤相关,结核病可作为Tr细胞功能研究的疾病模型.     

小鼠4-1 BB分子的配体识别主要区域定位及结构分析

目的 明确4-1 BB分子的配体结合4-1 BB分子胞外区的关键区域和基本结构.方法 分区表达鼠4-1 BB胞外区结构域及其天然配体,利用ELISA和Western blot等方法 对4-1 BB分子的配体识别结构域进行定位.结果 4-1 BB分子半胱氨酸寓集结构域(cysteine-rich domain,CRD)Ⅱ是配体结合的主要结构域,不结合CRD Ⅰ和CRDⅢ.免疫刺激性抗4-1 BB单克隆抗体2A,主要结合4-1 BB分子CRD与跨膜区之间的连接区(STP区),同时对包括CRDⅡ的各个CRDs有弱识别,可封阻4-1 BB与其配体结合.结论 4-1 BB分子配体的主要识别区位于4-1 BB分子胞外CRD Ⅱ,具有空间结构特点,此为进一步分析结合区及其关键氨基酸提供了资料.