人类白细胞抗原A表达沉默对大鼠脑内人细胞移植排斥反应的调节

背景：移植物主要组织相容性抗原复合物在移植排斥反应中起关键作用。用慢病毒介导的人类白细胞抗原RNA干扰技术可以降低T淋巴细胞的细胞毒作用和抗体介导的溶细胞作用，但尚未见相关体内研究报道。 目的：拟用携带人类白细胞抗原A小分子干扰RNA序列的慢病毒感染人胚肺成纤维细胞。再将其移植到帕金森大鼠纹状体．观察人类白细胞抗原A表达沉默对移植排斥反应的调节。 设计．时间及地点：细胞基因工程体内实验．于2005—09／2008-01在首都医科大学神经科学研究所完成。材料：清洁级12周龄雌性SD大鼠33只，用于建立帕金森动物模型。原代培养的人胚肺成纤维细胞取材于12周流产人胚胎，由北京京北医院提供，293T为贴壁依赖型成上皮样细胞。慢病毒载体系统由psicoR，pCMV—VSV—G和psPAX2三质粒组成，为美国Addgene公司产品。携带HLA—A2厂cDNA的pcDNA I／Amp—HLA质粒由比利时Ludwig肿瘤研究所Pierre van Bruggen教授惠赠。 方法：以携带HLA—A2 cDNA的pcDNA I／Amp—HLA质粒为模板PCR扩增HLA—A2 cDNA编码区序列．构建人类自细胞抗原A融合蛋白表达载体pEGFP—Flag-HLA，转染293T细胞。用HLA-A2编码区序列设计小分子干扰RNA 4个待选靶点序列．分别起始于编码区的第257，350．833，251位碱基，构建表达小分子干扰RNA慢病毒载体。用带有Flag标签的人类白细胞抗躁AcDNA表达载体转染293T细胞后，再进行不同靶点病毒直接感染。33只帕金森模型大鼠随机分为2组，实验组大鼠纹状体植入人类白细胞抗原A小分子干扰RNA病毒感染的人胚肺成纤维细胞．对照组植入带有小分子干扰RNA对照序列和绿色荧光蛋白病毒感染的人胚肺成纤维细胞。 主要观察指标：免疫组织化学染色检测脑内移植物人类白细胞抗原A、CD4和CD8的表达，用抗人细胞核的阳性表达评价移植细胞的存活情况。 结果：与对照组比较，实验组移植后4d、2周时人类白细胞抗原A阳性细胞均较少（t=3．301，2．631，P〈0．01，0．05）．6周时无明显变化；CD4阳性细胞仅移植后6周明显减少（t=2．269．P〈0．05）：移植后4dCD8阳性细胞无明显变化，2周及6周时明显减少（t=2．333．P〈0．05）：抗人细胞核阳性细胞仅移植后2周明显减少（t=2．952，P〈0．05）。 结论：人类白细胞抗原A表达敲减可以抑制移植排斥反应。但并不能显著延长移植物的存活时间。     

基因治疗帕金森病的分子生物学研究：神经营养因子Neurturin基因克隆及其真核表达

目的：克隆中国人Neurturin基因，重组携带Neurturin基因的真核表达载体，为研究Neurturln基因治疗帕金森病提供分子生物学基础。方法：实验于2003—03／2004—05在北京市神经再生修复研究重点实验室完成。采用RT-PCR方法从人胎儿脑中获取Neurturin cDNA，将其克隆至pGEM—Easy—T载体中。测序鉴定后，重组携带Neurturin基因的反转录病毒载体pLPCX-Neurturin；通过脂质体将重组载体转染PT67包装细胞系，用病毒上清感染NIH 3T3细胞系以检测病毒滴度。结果：RT-PCR扩增到人Neurturln cDNA片段，序列与Genebank登录的序列一致；将Neurturin基因亚克隆至反转录病毒载体得到插入方向正确的重组载体pLPCX-Neurturin，病毒上清滴度为5&;#215;10^4CFU／mL。结论：获得人Neurturln基因cDNA序列，检测到Neurturin基因在真核细胞中表达，并得到较高滴度的病毒上清。     

两种价态锰化合物对SH-SY5Y细胞损伤作用的体外研究

为探讨两种价态（2价和3价）锰化合物对SY5Y细胞的细胞毒性和引起细胞凋亡的作用，选择了多巴胺能神经细胞SH－SY5Y细胞作为受试系统，细胞活力测定结果显示Mn^2 和Mn^3 可依时间和剂量依赖性而使细胞的存活率减少，但Mn^3 的细胞毒性作用高于Mn^2 ，相差显微镜下观察，Mn^2 和Mn^3 刺激细胞24h后，细胞变圆，贴壁状态不好，HE染色得到相似的结果，在用流式细胞仪Mn^2 和Mn^3 的致凋亡作用中发现，不同价态锰均可引起SH－SY5Y细胞发生凋亡，但Mn^3 的致凋亡作用强于Mn^2 。     

羧基荧光素乙酰乙酸与四甲基偶氮唑盐法检测人脐血间充质干细胞刺激脾淋巴细胞增殖作用的比较

目的 比较羧基荧光素乙酰乙酸(CFSE)与四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测人脐血间充质干细胞(CB-MSCs)和神经分化的CB-MSCs对大鼠脾淋巴细胞(LCs)刺激作用的敏感程度. 方法 分别制备刺激细胞和LCs,将刺激细胞分为4组:1. CB-MSCs组;2. Dif-CB-HSCs组:脐血间充质干细胞培养7d后维甲酸(RA)处理4d诱导其神经分化细胞;3. SH-SY5Y组:人源SH-SY5Y细胞(人神经母细胞瘤细胞系)作为阳性对照组;4. Auto-LC组:自体大鼠LCs作为阴性对照组.分别将上述各组刺激细胞与LCs进行混合培养,分别通过酶标仪(MTT法),流式细胞术(CFSE法)检测LCs增殖情况( n =3). 结果 CFSE法和MTT法检测结果 均显示,CB-MSCs组和Dif-CB-MSCs组刺激LCs增殖明显弱于阳性对照组(SH-SY5Y细胞组),但CFSE法检测结果 显示,CB-MSCs组和Dif-CB-MSCs组细胞刺激LCs增殖百分率高于阴性对照Auto-LC组,MTT法检测结果 显示,CB-MSCs组和Dif-CB-MSCs组的吸光度( A )值稍低于阴性对照Auto-LC组. 结论 CFSE法比MTT法能更加客观地反映淋巴细胞增殖情况,在实际应用中更具有优势.     

Sertoli细胞对大鼠大脑皮质神经前体细胞的诱导分化作用

目的:研究Sertoli细胞对体外培养大鼠皮质神经前体细胞生长发育的促进作用,及向多巴胺能神经元分化的诱导作用.方法:将大鼠Sertoli细胞与14 d大鼠皮质神经前体细胞体外共培养,免疫细胞化学检测神经干细胞标记物巢蛋白,神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞标记物βⅢ-微管蛋白(βⅢ-tubulin)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和半乳糖脑苷脂(GalC),及多巴胺能神经元标记物酪氨酸羟化酶(TH)的表达情况.结果:随着共培养时间的延长,神经前体细胞中GFAP阳性细胞数量逐渐减少,而β-Ⅲ tubulin 阳性细胞数增多,并出现TH阳性神经元.结论:Sertoli细胞抑制体外培养的大鼠皮质神经前体细胞的生长,但具有显著促神经元分化作用,并能够诱导与其共培养的大鼠皮质神经前体细胞分化为多巴胺能神经元.     

HLA A表达沉默和酪氨酸羟化酶过表达的人成纤维细胞脑内移植治疗帕金森病大鼠模型

目的 观察人白细胞抗原A（HLA A）敲减和酪氨酸羟化酶(TH)过表达的人胚肺成纤维细胞(HELFs) 于脑内移植后帕金森病(PD)大鼠的旋转行为和脑内炎性反应。方法 用TH反转录病毒和携带HLA A干扰序列的慢病毒（表达绿色荧光蛋白GFP）感染细胞后移植于PD大鼠模型纹状体。移植后检测大鼠旋转行为,免疫组化染色观察TH、OX42、OX6和GFAP表达,GFP观察移植物存活。同时移植HELFs以及TH转导的HELFs和大鼠肺成纤维细胞作对照。结果 移植后GFP荧光细胞数量逐渐减少,HLA A敲减组细胞的减少相对较轻,但对大鼠旋转行为的改善不明显;OX42阳性小胶质细胞改变不明显,但OX6表达逐渐增加,而GFAP阳性细胞激活逐渐下降但仍强于移植对侧。结论 HLA A表达沉默细胞移植对大鼠运动症状改善不明显,细胞移植能激活小胶质细胞和星形胶质细胞。     

大鼠骨髓基质细胞在脑内的迁移和分化

目的研究骨髓基质细胞(bMSCs)在大鼠脑内的迁移和分化情况。方法体外分离培养大鼠四肢骨的bMSCs,原代培养8~10 d后,同时用含增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的反转录病毒上清转导bMSCs并进行抗性筛选,7~10 d可得到稳定表达EGFP的bMSCs,然后将EGFP标记的bMSCs通过侧脑室和尾静脉2种注射方式分别注入纹状体损伤的大鼠体内,进而观察bMSCs向脑内迁移和分化的情况。结果在移植后的大鼠脑内均观察到2种方式植入大鼠体内的bMSCs,这些EGFP阳性的细胞呈现出一些神经元和神经胶质细胞的形态并能表达一些神经元和神经胶质细胞的特异性标志物。结论骨髓基质细胞中确实含有能够向神经元方向分化的干细胞。     

帕金森病基因治疗的理论：VMAT2基因的表达及其对MN9D细胞多巴胺代谢的影响

目的：获得人Ⅱ型囊泡单胺转运体(vesicular monoamine transporter-2，VMAT2)基因，转染至MN9D细胞，通过检测细胞内外单胺类递质含量的变化评价VMAT2基因促进单胺类递质循环利用的效应。方法：从人胎脑中提取总RNA，RT-PCR方法扩增目的cDNA片段并将其重组于pGEM—Easy-T载体中，进行全序列测定。重组真核表达载体pBK-RSV-VMAT2，转染MN9D细胞，免疫细胞化学检测VMAT2的表达，HPLC检测细胞内外单胺类递质含量的变化。结果：RT-PCR扩增到1637bp的带有Kozak序列的eDNA片段。原位杂交证实pAAV-VMAT2能在COS7细胞表达；免疫组化证实转基因的MN9D细胞(实验组)、MAT2免疫着色明显高于对照组。HPLC结果表明实验组中细胞内外的多巴胺含量分别升高至(227．2&;#177;20．8)％和(302．6&;#177;15．7)％(P&;lt;0．01)，而细胞外HVA、DOPAC分别降低至(48．1&;#177;5．3)％和(55．7&;#177;4．9)％(P&;lt;0．05)，细胞内HVA，DOPAC分别升高至(332．1&;#177;28．2)％和(1176．8&;#177;82．5)％(P&;lt;0．01)。结论：克隆了VMAT2cDNA片断，可在真核细胞中表达。该基因的过表达可促讲多巴胺的循环利用．有望用于帕余森病的基因治疗。     

Nurrl基因在大鼠体外培养骨髓基质细胞的表达

目的：为获得高效表达孤儿核受体(orphan nuclear receptor，Nurrl)基因的骨髓基质细胞。方法：采用分子克隆技术，构建携带Nurrl基因的重组腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)载体；与包装质粒pAAV-RC和辅助质粒phelper一起用磷酸钙法转染包装细胞HEK293制备具有感染活性的AAV-Nurrl病毒粒子；用病毒上清液感染原代培养的大鼠骨髓基质细胞(Marrow stromal cells，MSCs)，并用免疫细胞化学方法检测阳性细胞。结果：经酶切鉴定和DNA测序，得到了序列正确的重组pAAV-Nurr1；感染HTl080细胞进行病毒滴度测定，每mL病毒贮存液可达10^12个阳性细胞；获得了Nurrl阳性的骨髓基质细胞，阳性率在60％以上。结论：重组AAV携带的Nurrl基因能够在MSCs中表达，本文为进一步探讨将该细胞用于帕金森病基因治疗的可能性研究奠定了基础。     

帕金森病恒河猴模型基因治疗的实验研究

帕金森病恒河猴模型基因治疗的实验研究首都医科大学北京神经科学研究所徐群渊张进禄刘玉军赵春礼王元身王珂鲁强首都医科大学宣武医院影像中心李坤成谷晔炳选用恒河猴５只，雌雄不限，体重３～８ｋｇ。经一侧颈内动脉注射ＭＰＴＰ制成偏侧帕金森病（ＰＤ）动物模型。将经...