表达结核特异性 Vγ9 Vδ2 TCR 双链单体的果蝇 S2恒定细胞系的构建和鉴定

目的：转染及筛选鉴定能够稳定表达和分泌V γ9Vδ2 T细胞受体（ TCR）双链单体的果蝇S2恒定细胞系。方法利用氯化钙转染法将TCR γ9-FB-pMT／V5-His B质粒、TCR δ2-JB-pMT／V5-His A质粒、pMT／Bip-BirA质粒和pCoHygro潮霉素质粒转染进S2细胞中,用潮霉素B筛选恒定细胞系后表达生物素化的结核特异性Vγ9Vδ2 TCR双链单体,并加以鉴定。结果斑点印迹试验、SDS-PAGE和Western blot表明细胞培养上清中有V γ9Vδ2 TCR单体,且已被成功生物素化。结论成功筛选出能稳定分泌表达Vγ9 V δ2 TCR的果蝇S2恒定细胞系,为研究γδ T细胞的免疫识别提供实验资料。     

海洋抗结核分枝杆菌活性物质研究近况

近年来由于结核杆菌多重耐药菌株及人体免疫缺陷病毒双重感染的出现,使结核病的发病率和死亡率呈上升趋势,开发新的抗结核药物具有重要的社会意义和经济意义。海洋由于其独特的环境,造就了种类繁多、结构新颖多样的生物活性物质,为抗结核病的药物开发提供了广泛的前景。本综述以近年报道的抗结核分枝杆菌活性物质,包括肽类化合物,生物碱类化合物,萜类化合物等为例。简要介绍海洋活性物质的研究近况。     

应用E7多肽/HLA-DR8四聚体监测治疗前后肺结核患者外周血多肽特异性CD4~＋ T细胞的变化

目的 监测治疗前及治疗6个月内各时间点肺结核患者外周血E7多肽特异性CD4+T细胞及总CD4⁺T细胞的变化。方法 应用已有的果蝇S2恒定细胞株,分别表达、纯化获得2种生物素化E7/HLA-DR8（E7/HLA-DRB1*08032和E7/HLA-DRB1*0818）复合物单体,进而制备成相应四聚体,分别用2种四聚体与抗人CD4-FITC共染色,流式细胞分析检测治疗前以及规律抗结核治疗15、30、45、60、90、120、150、180 d肺结核患者外周血四聚体阳性（E7多肽特异性）CD4⁺ T细胞及总CD4⁺ T细胞,同时以健康成人对照者、非结核呼吸道感染患者外周血及脐带血作为研究对照。结果 多数病例的外周血总CD4⁺ T细胞在治疗前略低于正常水平,随着治疗开始很快升高并在短期内恢复至正常水平;但除治疗前组与脐带血差异有统计学意义（P<0.05）外,治疗前后各组之间,以及治疗前组与健康成人、非结核呼吸道感染者之间的差异无统计学意义（P>0.05）。治疗前以及规律抗结核治疗15、30、456、0 d内肺结核患者组外周血可检出高水平的四聚体阳性CD4+ T细胞,与60 d后各组及3个对照组差异均有统计学意义（P<0.01或P<0.05）,2种四聚体之间的检测结果无统计学意义（P>0.05）;肺结核患者外周血四聚体阳性CD4+ T细胞在治疗前即有较高水平,治疗1560 d后达到最高,一些患者中间有波动,以后开始逐渐降低甚至降至正常水平。结论 多肽/HLA-DR四聚体可以用于监测治疗前后结核患者外周血多肽特异性CD4⁺ T细胞的变化,配合总CD4⁺ T细胞的检测,对于治疗期结核患者疾病发展和恢复的监测具有指导意义。     

青蒿琥酯及二氢青蒿素逆转耐药结核分枝杆菌的初步研究

[目的]了解青蒿素类中药单体(二氢青蒿素、青蒿琥酯)单独或联合利福平(RVP)及异烟肼(INH)对耐药结核分枝杆菌的作用,初步研究此类单体是否具有逆转细菌耐药性的作用.[方法]刃天青显色法判断各中药单体是否有抑菌或杀菌作用;MB/BACT系统(生物梅里埃)检测RFP或INH联合中药单体是否有逆转细菌耐药的作用.[结果]单独使用时各单体均不能杀灭结核分枝杆菌;RFP联合青蒿琥酯(200μg/mL)或二氢青蒿素(200μg/mL)可使11株耐RFP菌株中的9或6株变为敏感,敏感率分别为82%或55%;INH联合上述中药单体则亦可使11株耐INH菌株中的10或7株变为敏感,敏感率分别为90%或64%.[结论]青蒿琥酯及二氢青蒿素有较强的协同相应抗结核药或逆转结核菌的耐药性的作用,但青蒿琥酯敏感率较二氢青蒿素更高.     

PCR和分离培养检测细胞培养支原体污染的比较

目的：检测细胞培养中支原体的污染,建立支原体通用的ＰＣＲ方法。方法：根据已出版的序列设计并合成一对支原体（柔膜体纲）１６ＳｒＲＮＡ基因组特异引物。对实验室所存的１２种支原体、大肠杆菌、变形杆菌及无支原体污染的组织培养细胞进行了ＰＣＲ扩增。以ＰＣＲ与分离培养比较检测了３３份细胞培养标本。结果：１２种支原体均出现了约６２０ｂｐ左右的特异性扩增带,敏感性为１００～１０００个支原体细胞,且常见的６种细胞培养污染支原体的扩增片段均能被ＨｉｎｄⅢ切成２８０与３４０ｂｐ左右的２条带。理论上推测这对引物可扩增所有支原体１６ＳｒＤＮＡ。但对大肠杆菌、变形杆菌及无支原体污染的组织培养细胞等未见有扩增带出现。在对３３份细胞培养标本的检测中,除ＰＣＲ和分离培养同时检出２份阳性外,前方法还另检出阳性３份。５份ＰＣＲ扩增物均被ＨｉｎｄⅢ切出２条带。结论：ＰＣＲ较分离培养敏感性高,可提高细胞培养污染支原体的检出率,防止出现假阴性结果;如做好质量控制,对于一般实验室检测细胞培养支原体污染,ＰＣＲ扩增较分离培养具有更大的应用意义     

PCR技术在鼠肺支原体检测中应用的初步研究

目的　研究不同培养条件对小鼠卵母细胞体外成熟及体外受精率的影响。方法　小鼠卵母细胞分别在含有FSH、BSA和胰岛素的培养液中体外成熟,在Whitten 氏液中体外受精,比较体外成熟率、体外受精率。结果　1- 裸卵(DO) 的体外成熟率、体外受精率(81-4% ,31-0 % ) 均高于卵丘卵母细胞复合体(COC)(48-6 % ,27-1% ) 。2- 在培养液中添加FSH、胰岛素和BSA,卵母细胞的体外成熟率为77-9 % ,82-3% 、60-7% ;体外受精率为77-2 % 、72-6 % 、26-7% ;2 - 细胞率为49-2 % 、34-2 % 、10-0% 。胰岛素组的卵母细胞IVM 率最高,但IVF率、2 - 细胞率低于FSH 组。3- 添加BSA的两组的体外受精率只有26-7 % 、25-8 % ,显著低于其他组,其体外成熟率也较添加FSH 和胰岛素的组成。4- 排出第一极体(PbI) 的卵母细胞的体外受精率和2 - 细胞率(85-9 % ,22-4% ) 均高于GV期卵母细胞(71-1 % ,12-9 % ) 。结论　1- 卵丘卵母细胞(COC) 较裸卵(DO) 的体外成熟率、体外受精率都低,差异显著(P成熟< 0-01;P受精< 0-05) 。2-FSH 和胰岛素均能提高小鼠卵母细胞的体外成熟率、体外受精率。3-BSA可以降低小鼠卵母细胞体外受精率,差异极显著。4-GV 期卵母细胞的体外受精率显著低于体外培养的排出第一极体的卵母细胞(P2 - cell < 0-05,P受精<0-05)     

支原体全DNA光敏生物素探针杂交方法的建立

支原体基因组全ＤＮＡ分子量较小，本研究直接制备肺炎支原体（ＭＦ），人型支原体（ＭＨ）和解脲脲原体（ＵＵ）中３个型ＳＵ１，ＳＵ４，ＳＵ８全ＤＮＡ光敏生物素探针，用斑点杂交鉴定表明探针可用于检测同种支原体，但３个型ＵＵ探针不能用于型别鉴定。探针检测灵敏度较一般片段ＤＮＡ探针灵敏度低，可能是由于前者分子量放大，降低了杂交速率和效率。直接提取全ＤＮＡ作光敏生物素标记，简化了探针制备过程，且无放射性损害及衰减，探针易于保存，可供一般实验室及化验室使用     

应用CD4+Vα9-J27/Vβ29-D1-J2四聚体检测结核分枝杆菌感染的初步研究

目的 初步探讨CD4+ Vα9-J27/Vβ29-D1-J2 TCR四聚体对结核分枝杆菌感染检测的特异性.方法 应用果蝇S2恒定细胞株表达、纯化获得生物素化TCR复合物单体制备四聚体.流式检测PE-四聚体与细胞株膜结核抗原肽/HLA-DR复合物以及肺结核患者外周血的单核细胞的结合百分率,并设立病例对照组.激光共聚焦倒置显微镜观察肺结核病理组织及对照组织中四聚体与结核抗原双染阳性的细胞及四聚体与CD14双染阳性细胞.结果 四聚体对表达C14/HLA-DRB1 *1504的细胞株结合能力最强.四聚体与结核患者外周血单核细胞结合率显著高于各对照组.结核组织标本可观察到四聚体与CD14双染阳性及四聚体与结核抗原双染阳性的细胞;而对照组织均为阴性.结论 CD4+ TCR四聚体对结核检测有一定的特异性,为TCR四聚体应用于结核的诊断和免疫机制研究提供了一定的实验资料.     

生物安全三级实验室甲醛熏蒸消毒灭菌效果评价

<正>生物安全三级实验室是按照我国《病原微生物实验室生物安全管理条例》[1]和《实验室生物安全通用要求》(GB19489-2008)[2]等有关病原微生物实验室生物安全法规和标准,以及WHO《实验室生物安全手册》(第三版)[3]中的三级生物安全     

关于生物安全三级实验室管理体系构建的思考

 自 2003 年暴发 SARS 疫情以来，我国政府以及相关职能部门对境内病原微生物实验室的管理给予了高度重视，陆续从政府层面上出台了一系列法律、法规和相关标准，国务院各相关职能部门层面上提出了有关具体要求，明确了生物安全三级、四级实验室必须通过中国合格评定国家认可委员会的认可后方可使用的严格政策。对拥有生物安全实验室的机构而言，硬件建设（设施、设备）检测验收的结束仅仅是工作的开始，能否获得国家相关认可使生物安全三级实验室尽快投入使用，关键在于生物安全实验室管理体系的构建。现结合我们近年来在构建生物安全实验室管理体系等方面的实践谈几点想法，供同道参考。......