E7多肽的抗原表位特性与多肽反应阳性结核患者的HLA-DR等位基因分析

目的:分析结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)E7多肽的T细胞抗原表位特性,克隆及分析E7多肽反应阳性的结核患者HLA-DR等位基因。方法:应用从结核患者末梢血分离的单个核细胞(PBMC),以IFN-γ-ELISPOT和细胞内细胞因子染色分析MTB E7多肽的T细胞抗原表位特性;从E7-ELISPOT阳性反应的PBMC或胸水细胞中扩增、克隆和分析HLA-DRα和β链等位基因。结果:311例患者IFN-γ-E7-ELISPOT检测显示233例阳性(阳性率75%),阳性结果的平均SFC为210个斑点/106细胞,E7和另一多肽(E6多肽)混合检测529例患者则显示492例阳性(阳性率93%),平均SFC为572个斑点/106细胞;E7多肽刺激后,19例患者的PBMC经细胞内细胞因子染色结果显示能产生IFN-γ的CD4+T细胞百分率为0.63±1.30,而5例健康对照者为0.05±0.056,两者有显著性差异(P<0.004);扩增、克隆出了共有的HLA-DRA*0101和15种HLA-DRB1等位基因。结论:E7是一种理想的广谱HLA-DR限制性CD4+T细胞反应性多肽,为深入研究结核患者的HLA-DRB等位基因的分布特点以及制备相应四聚体建立了基础。     

CD277~(+/-)的备选抗原递呈细胞在γδ T细胞识别不同抗原中的限制性递呈作用

目的研究CD277~(+/-)备选抗原递呈细胞(APC)在γδT细胞识别抗原中的限制性递呈作用。方法将流式分选的结核患者胸水或脐带血中的γδT细胞,用CFSE标记后与CD277~(+/-)备选抗原递呈细胞按1∶1比例混合培养,加或不加HMBPP或多肽E7刺激,使用流式细胞术检测γδT细胞增殖情况;以Transwell小室共培养法研究细胞相互接触对其增殖的影响。结果磷酸化抗原HMBPP或结核特异性多肽E7的体外刺激作用下,结核患者胸水和脐带血中的CD277~(+/-)的备选抗原递呈细胞都可引起γδT细胞不同程度的活化增殖,且CD277~+细胞的活化作用强于CD277~-细胞。不同个体来源的单核细胞系的备选APCs相对于淋巴细胞系的备选APCs更容易引起γδT细胞的增殖,其中以CD1a~+CD277~+CD14~-CD1b~-CD1c~-的细胞的抗原递呈效应最为明显,且通过小室实验证实了γδT细胞的增殖过程需与APCs相接触来实现。结论 CD277分子对γδT细胞识别不同抗原有一定限制性递呈作用,需进一步研究相关分子机制从而为γδT细胞的抗结核免疫机制以及相关的免疫治疗提供依据。     

HMBPP/多肽E7对结核患者胸水及脐带血中γδ T细胞分泌IL-6的影响

目的研究4-羟基-3-甲基-2-烯基焦磷酸（HMBPP）和多肽E7对结核患者胸水及脐带血中γδ T细胞分泌白介素6（IL-6）的影响和机制。 方法收集自广州市胸科医院临床诊断结核性胸膜炎患者胸水标本18例，自中山大学附属第三医院正常健康产妇脐带血标本17例。使用流式分选技术分选出结核性胸水和脐带血中的γδ T细胞与CD277^＋CD14^＋单核-巨噬细胞混合培养，分别用HMBPP或E7刺激后，运用流式细胞术检测分泌IL-6的γδ T细胞百分率及表达程序性死亡配体1（PD-L1）的CD277^＋CD14^＋单核-巨噬细胞百分率；利用RT-PCR技术检测细胞中IL-6、PD-L1的mRNA表达水平；用ELISA方法检测细胞培养上清中IL-6的含量；用PD-L1特异性小分子干扰RNA（siRNA）沉默PD-L1的表达以检测PD-L1是否参与分泌IL-6；在分选于结核性胸水和脐带血的共培养细胞中，HMBPP或E7刺激后上述指标在每一时间点对照组和实验组间分别采用独立样本t检验比较其差异，分析其统计学意义。 结果在结核性胸水和脐带血中，给予HMBPP或E7刺激24 h之后，与对照组相比IL-6^＋γδ^＋ T细胞占比显著升高，给予HMBPP或E7刺激12 h之后γδ T细胞中IL-6在mRNA水平的相对表达量显著上调，以及在蛋白质水平的表达显著上调；在分选于脐带血的共培养细胞中，给予HMBPP或E7刺激，CD277^＋CD14^＋单核-巨噬细胞中PD-L1在mRNA水平的相对表达量显著上调［（3.70±0.33）vs（4.20±0.34）vs 1.00］；在沉默PD-L1的表达后，γδ T细胞中IL-6的表达显著降低［（0.53±0.03）vs（0.55±0.01） vs 1.00］，差异均具有统计学意义（P均<0.05）。 结论HMBPP和多肽E7能够促进CD277^＋CD14^＋单核-巨噬细胞PD-L1表达上调，后者参与刺激与其共培养的γδ T细胞分泌更多的IL-6，这为γδ T细胞的抗结核免疫机制的研究以及结核患者的免疫治疗提供依据。     

用自制全细胞抗原检测肺炎支原体抗体ABC-ELISA方法的建立及应用

用自制全细胞抗原建立了ABC－ELISA检测MP－IgG抗体方法，其敏感性高于常规ELISA和以美国产抗原建立的CF方法，特异性和重复性也好。应用该方法检测了62例来自广州市两家医院儿科肺炎住院儿童的血清和79例广州市某高校健康大学生体检血清．结果显示肺炎儿童组8例抗体阳性，占病例总数的12．9％，抗体最高滴度为1∶800，一般为1∶200～1∶400，其中有2例双份血清抗体滴度增高4倍或以上，且随着年龄的增长，抗体阳性例数和P／N比值均增高（有显著性差异，t检验分完。1为P＜0．005和P＜0．01）；大学生组50例抗体阳性，抗体最高滴度为1∶12800，一般为1∶1600～1∶3200。提示，在广州市儿童和大学生中存在MP感染；支原体过儿童肺炎占儿童肺炎病因一定比例。MP感染率和抗MPIgG抗体水平在儿童中有随年龄增长而逐渐增加的趋向。     

全DNA光敏生物素探针杂交法检测支原体

分别以人型支原体（ＭＨ）、解脲支原体（ＵＵ）三个血清型（ＳＵ１、ＳＵ４与ＳＵ８）全ＤＮＡ与等体积光敏生物素混合，用特种紫外照射制备成探针，在分离培养的基础上，用上述全ＤＮＡ光敏生物素探针，对８２例非淋菌尿道炎病人标本作了检测。结果分离培养ＭＨ２２例，ＵＵ５例，探针法检出ＭＨ２０例，ＵＵ５３例，两方法ＭＨ、ＵＵ阳性标本均有重叠，提示ＵＵ感染率较ＭＨ感染率高，且ＭＨ感染多数伴随在ＵＵ感染中。三型ＵＵ探     

结核特异性CD4+ α/β TCR四聚体细胞株筛选技术的建立和应用

目的应用不同的MTB多肽以及不同的HLA-DR基因构建的膜表面表达结核抗原肽/HLA-DR复合物的S2恒定细胞株,即人工APC筛选、鉴定结核特异性CD4+α/βTCR四聚体。方法以PE标记的CD4+α/βTCR四聚体、FITC标记的抗HLA-DR抗体(L243),分别与未诱导表达或CuSO4诱导表达后的膜表面表达结核抗原肽/HLA-DR的果蝇S2恒定细胞株,以及与无多肽或结合有结核多肽的、表达HLA-DR的S2细胞株共孵育,流式细胞技术检测分析TCR四聚体与各种细胞株结合率的差异。结果 TCR四聚体6M、6N均与2#细胞株,即C5/HLA-DRB1*0404(1.73%、5.93%)等具有较高的阳性结合率;结核抗原肽孵育后,一些人工APC的四聚体阳性结合率有所提高;所筛选的9个TCR四聚体均与2#细胞株有较高的结合率。结论膜表达结核抗原肽/HLA-DR的S2细胞株,可以应用于结核特异性CD4+α/βTCR四聚体的筛选、鉴定;构建的9个CD4+α/βTCR四聚体均为结核特异性。     

应用CD4^＋TCR四聚体-流式分析和细胞爬片法检测分析外周血结核抗原特异性CD14＋单核细胞

目的：探讨CD4^＋ TCR四聚体‐流式分析和细胞爬片法检测分析外周血结核抗原特异性CD14^＋单核细胞的应用价值。方法应用四聚体对肺结核患者（肺结核组）外周血进行染色,流式检测四聚体阳性CD14^＋细胞的百分率,以非结核呼吸道感染患者（非结核呼吸道感染组）外周血及脐带血标本（脐带血组）作为研究对照。将肺结核组和对照组外周血制作成细胞爬片,用四聚体‐细胞爬片法原位染色,激光共聚焦倒置显微镜观察细胞爬片中四聚体与结核抗原双染阳性及四聚体与CD14双染阳性细胞的分布情况。结果应用CD4^＋ Vα21‐J39／Vβ29‐D1‐J2 TCR四聚体检测肺结核组、非结核呼吸道感染组和脐带血组的四聚体阳性CD14＋细胞百分率中位数分别为1．32％、0．50％和0．26％,而CD4^＋ Vα21‐J39／Vβ29‐D2‐J2 TCR四聚体则分别为1．05％、0．49％和0．19％。肺结核组外周血CD14＋单核细胞百分率显著高于各对照组。细胞爬片法可观察到肺结核组四聚体与CD14双染阳性及四聚体与结核抗原双染阳性的细胞,而对照组标本均为阴性。结论 CD4^＋ TCR四聚体技术,结合细胞流式和细胞爬片原位染色方法,能在体外敏感地检测出结核抗原特异性CD14^＋单核细胞,可以更准确地评价其在结核感染者体内的变化特征及临床意义。     

硕士生医学微生物学教学的思考

众所周知 ,知识经济时代已经到来 ,随着医学科学技术的迅猛发展 ,知识更新速度加快 ,各学科间相互交叉 ,相互渗透 ,边缘学科和新学科不断涌现。如何适应新形势下医学研究生培养的需要 ,笔者主要针对医学研究生微生物学教学谈一些自己的看法及建议。1 .医学硕士生微生物学教学中存在的问题1 .1　教材老化。教学是学校培养人才的基本途径 ,而教学又是以教材为中间媒介的一个完整的系统。由于研究生医学微生物教学并没有确定的教材 ,现在大多使用的是 1 991年出版的《现代微生物学》,而进入 90年代 ,分子技术的迅猛发展 ,已经把微生物学推上了…     

结核性胸膜炎胸水CD4+与CD8+ T细胞的TCR和CDR3谱型分析

本研究的目的是了解结核性胸膜炎患者胸水中CD4^＋、CD8^＋T细胞聚集情况，并建立高效、灵敏的TCRα和β链多重PCR扩增方法，扩增出其特异性CD4^＋、CD^＋T细胞的TCRα和β链全长编码序列，研究病变局部特异性克隆增殖TCR的重排特点以及CDR3（complementarity-determining region 3）谱型，可供构建结核分枝杆菌（Mtb）特异反应性TCR四聚体参考。