肝细胞生长因子促进脊髓组织块离断神经突起再生的体外观察

背景：肝细胞生长因子可促进体外培养的皮层神经细胞突起生长，在无血清条件下支持皮层神经元的存活，因此被认为是一种新发现的神经营养因子。 目的：采用半固体培养基系统培养脊髓组织块，原位观察脊髓组织块神经突起再生及肝细胞生长因子对组织块神经突起再生的作用。 设计：观察对比实验。 单位：解放军军事医学科学院放射医学研究所实验血液学研究室。 材料：实验于2004-08／2005-05在解放军军事医学科学院放射医学研究所实验血液学研究室和基础医学研究所神经生物学研究室完成。选用40只Wistar胚胎大鼠，孕期14-16d，由解放军军事医学科学院动物中心提供。鼠尾胶原取自成年250&;#177;50g雄性Wistar大鼠。 方法：①用自备的鼠尾胶原制作半固体培养基系统，无菌条件下快速分离出孕期14-16d胚鼠的脊髓，剪成0．5-1．0mm^3的小块，置于半固体培养基中作为原代培养，组织块生长5d时，将发出的神经突起在距离脊髓组织块约200mm处离断，并在离断远端将约2mm^2大小的鼠尾胶去除，用2mL鼠尾胶原重新铺缺损区，待新铺鼠尾胶原固化后加液体培养基作为二代培养，在离断后0，l，6，12和24h，通过显微镜原位连续观察神经突起再生。②将突起离断后的培养基改为含0．5％的N3条件培养基，以加入10μg/L肝细胞生长因子作为实验组，加入含0.5％N3的无血清的DMEM培养基作为对照组，用每个组织块再生突起最长的3根突起长度均值代表这个组织块神经再生情况，每组分别观察12个组织块，24h后观察计算两组神经再生突起长度，比较两组神经突起再生情况。 主要观察指标：①原位神经突起再生情况。②对照组与实验组神经突起再生状况比较。 结果：①原位神经突起再生情况：刚离断时在离断部位两侧神经突起开始崩解，持续时间约1.2h，在离断近端延伸的距离约20mm。此后近端神经突起逐渐变得增粗、肿胀，神经突起停止崩解并开始向外延伸，神经再生开始，而且再生速度在划伤12h后明显加快。再生的神经纤维较划伤前的纤维分支增多。②对照组与实验组神经突起再生情况：实验组神经再生突起长度明显大于对照组[（375&;#177;96）mm，（200&;#177;75）mm,（P〈0.05）]。 结论：①建立了一种原位观察神经组织块突起再生的方法，此方法简单、经济。②肝细胞生长因子体外能促进脊髓组织块神经突起再生。     

HCV HVR1相关基因诱导小鼠免疫反应的比较

目的 对小鼠进行两种基因免疫方法的比较:分别以真核质粒pcDN3.1( )为载体和以伤寒减毒活菌苗为载体,携带丙肝病毒高变区1(HVRI)相关模拟表位的DNA序列,诱导细胞免疫应答,以寻找较好的疫苗免疫途径.方法 根据HCV HVR1模拟表位的肽序列合成DNA序列,并将其连接到pcDN3.1( )(pcDN3.1-SP)真核质粒上,然后用重组质粒转化伤寒减毒活菌苗Ty21a(Ty21a-SP).Ty21a-SP和peDN3.1-SP分别经口服和肌注免疫小鼠后,杀鼠、分离脾细胞,脾细胞经混合肽刺激后,用流式细胞仪检测CD8 IFN-γ 细胞;用非放射性MTS法检测细胞增殖反应;以非放射性LDH法检测CTL反应.结果 对小鼠用pcDN3.1-SP和Tyr21a-SP免疫后,取脾淋巴细胞经混合肽刺激后,明显增殖,CD8 IFN-γ 淋巴细胞比例增高,并诱导较强的CTL反应,但pcDN3.1-SP免疫后的上述反应较Ty21a-SP免疫弱.结论 使用伤寒减毒活菌苗作为载体进行基因免疫有利于产生细胞免疫反应.     

双价痢疾工程疫苗经粘膜免疫动物的实验研究

目的探讨不同粘膜免疫途径对2株痢疾工程疫苗免疫效果的影响.方法用FSM-2117或FS-5416以4×107CFU/只分别经滴鼻、灌胃和小肠内免疫小鼠,3次免疫后7?d分离小鼠脾、派伊尔结(PP)、肠系膜中心淋巴结(MLN)、小肠淋巴细胞固有层(LPL)、鼻通道(NP)及NALT淋巴细胞,用BA-ELISASPOT法检测其特异性抗FSM-2117或FS-5416全菌抗原的IgA、IgG-ASC(抗体分泌细胞)数量.结果2株疫苗经鼻内免疫都诱发了鼻粘膜相关淋巴组织、胃肠粘膜相关淋巴组织以及代表系统免疫反应的脾淋巴细胞全菌抗原特异性IgA、IgG-ASC的显著增加(P＜0.05和0.01).小肠内免疫后,可有效诱发肠粘膜局部以及脾淋巴细胞全菌抗原特异性IgA、IgG-ASC的显著增加(P＜0.01),但不能刺激鼻粘膜局部淋巴细胞的特异性ASC反应.结论2株疫苗经鼻粘膜免疫均可诱导NALT和GALT及系统免疫反应的发生,是一个可行的免疫途径.     

双价痢疾菌苗滴鼻免疫小鼠诱导粘膜与系统免疫反应

目的探讨双价痢疾菌苗滴鼻免疫后对小鼠不同粘膜部位和系统免疫部位的影响.方法BALB/c小鼠随机分为3组,每组20只,FSM-2117或FS-54164×107CFU/只经滴鼻途径免疫小鼠,间隔2w,3次免疫后7d活杀,分离NALT、鼻通道、脾、小肠PP及MLN淋巴细胞,采用流式细胞术检测其淋巴细胞表型的变化;收集鼻咽、肺、肠、生殖道冲洗液和血清,采用ELISA法检测其中特异性抗福氏、宋内氏LPSIgA和IgG.结果两株菌苗经鼻内免疫都诱发了鼻咽、肺、胃肠道和生殖道等不同粘膜部位及血清中特异性抗福氏、宋内氏LPSIgA、IgG的显著增加(P＜0.01);NALT、NP和PP淋巴细胞中CD3+T细胞显著增加,其中以CD4+T细胞增加为主;FSM-2117免疫组的脾细胞中B220+细胞显著增加,而FS-5416免疫组的脾细胞中CD3+T细胞显著增加.结论两株菌苗经鼻粘膜免疫均可诱导不同粘膜部位及系统免疫反应的发生,鼻粘膜是一个安全有效的免疫途径.     

两株双价痢疾工程菌苗不同粘膜免疫途径的免疫原性

目的探讨免疫途径、接种剂量及侵袭蛋白表达对两株双价痢疾工程菌苗免疫效果的影响。方法小鼠分为滴鼻、灌胃和对照组 ,分别以不同剂量免疫 3次 ,间隔 2周 ,3次免疫后 7d收集血清、小肠、鼻咽、肺、阴道冲洗液 ,EL ISA法检测其中特异性福氏、宋内氏 L PS- Ig A和 Ig G。结果 4× 10 7CFU菌苗经鼻途径免疫即可诱导多个粘膜部位以及血清双价特异性抗体显著增高 ;菌苗剂量增加 2 0、2 0 0倍时经灌胃免疫诱发较为局限的粘膜特异性抗体增高。结论鼻粘膜免疫不仅诱导多个粘膜部位 (特别是生殖道 )以及系统免疫的抗体反应 ,是一个安全有效的免疫途径。     

乙型肝炎病毒e抗原在肝细胞内作用蛋白AK026018亚细胞定位的研究

目的：确定肝细胞内乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)作用蛋白AK026018的亚细胞定位，初步研究该蛋白的生物学功能。方法：应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术，从HepG2细胞中扩增编码AK026018蛋白的全基因，构建真核表达载体pEGFP-AK，转染HepG2、293T细胞系，在激光共聚焦荧光显微镜下与转染空载体pEGFP-N1的细胞比较观察。结果：经限制性内切酶分析和DNA序列测定鉴定构建的重组表达载体正确。通过激光共聚焦荧光显微镜观察，转染了重组栽体pEGFP-AK的细胞绿色荧光信号较集中分布于胞浆中。而空载体pEGFP-N1转染的细胞绿色荧光信号在整个细胞中均匀分布。结论：成功分离了AK026018全基因序列并构建了真核表达载体，该基因表达产物亚细胞定位于细胞浆中。     

痢疾菌苗滴鼻免疫小鼠诱导不同部位淋巴组织的免疫应答

目的 探讨痢疾菌苗滴鼻免疫后，小鼠不同粘膜部位和其它部位免疫应答的影响。方法将Ｂａｌｂ／ｃ小鼠随机分为３组，每组１５只。舰疾菌苗株 ＴＩＭ－２１１７或 ＦＳ－５４１６，按 ５×10～6、１×１０～７、４×１０～７和４×１０～７ＣＦＵ／只滴鼻跟 Ｂａｌｂ／ｃ小鼠４次涧隔两 ｗｂ。分离鼻相关淋巴组织（ＮＡＬＴ）、鼻通道（ＮＰ）及脾、小肠的ＰＰ结淋巴细胞。一部分细胞采用流式细胞术检测淋巴细胞表型的变化；另一部分细胞与全菌破碎抗原共培养，于不同时间点取出，提取ＲＮＡ做ＲＴ－ＰＣＲ。结果两株菌苗经鼻内免疫后，ＮＡＬ、ＮＰ和ＰＰ结的淋巴细胞中ＣＤ３Ｔ细胞显著增加，其中以ＣＤ４＋Ｔ细胞增加为主。ＴＳＭ－２１１７株免疫组的脾细胞中，Ｂ２２０＋细胞显著增加；而ＦＳ－５４１６株免疫组的脾细胞中，ＣＤ３＋Ｔ细胞显著增加。免疫小鼠的ＮＡＬＴ、ＮＰ和ＰＰ结淋巴细胞，在体外经抗原刺激后，均在不同时间出现ＩＦＮ－γ和ＩＬ-４ｍＲＮＡ的表达，ＴＧＦ－β ｍＲＮＡ的表达在免疫前后无明显变化。结论痢疾菌苗经鼻粘膜免疫，可诱导不同粘膜部位及全身免疫应答的产生。     

双价痢疾疫苗滴鼻免疫小鼠诱导持续性粘膜与系统免疫反应

用双价痢疾疫苗 (ＦＳＭ 2 117)滴鼻免疫小鼠后 7、30和 90ｄ ,分别观测粘膜和系统免疫反应的变化。疫苗经鼻内免疫后 7ｄ ,诱发鼻咽、肺、胃肠道和生殖道等不同粘膜部位及血清中特异性抗福氏、宋内ＬＰＳＩｇＡ、ＩｇＧ水平显著增高 (Ｐ <0 .0 1) ,而特异性抗体水平在免疫后 30、90ｄ明显下降 ,尤其是胃肠道和鼻咽部粘膜 ,但仍明显高于ＰＢＳ对照组水平 ;疫苗滴鼻免疫后 7ｄ ,小鼠ＮＡＬＴ、ＮＰ和ＰＰ淋巴细胞中ＣＤ3+ Ｔ细胞显著增加 ,其中以ＣＤ4 + Ｔ细胞增加为主 ,脾细胞中Ｂ2 2 + 细胞显著增加 ;4次免疫后 30ｄ ,ＮＡＬＴ、ＮＰ和脾…     

双价痢疾菌苗滴鼻免疫小鼠后不同部位淋巴细胞表型的变化

目的:观测双价痢疾工程菌苗滴鼻免疫小鼠后,不同时间、不同部位淋巴组织细胞表型的变化,探讨痢疾菌苗滴鼻免疫对黏膜和系统免疫应答的影响。方法:BALB/c小鼠随机分为3组,每组30只,分别以FSM-2117和FS-5416痢疾菌苗经滴鼻途径免疫小鼠4次,菌量依次为5×106、1×107、4×107和4×107CFU/只,对照组给予PBS,间隔2 wk。4次免疫后7、30和90 d活杀,分离NALT、鼻通道、脾、小肠PP结淋巴细胞,采用流式细胞术检测其淋巴细胞表型的变化。结果:4次免疫后7 d,小鼠鼻相关淋巴组织(NALT)、鼻通道(NP)和Peyer’s结(PP)淋巴细胞中,CD3 T细胞数均显著增加,其中以CD4 T细胞增加为主。FSM-2117免疫组的脾细胞中B220 细胞显著增加;而FS 5416免疫组的脾细胞中CD3 T细胞显著增加。4次免疫后30 d,NALT、NP和脾淋巴细胞仍出现上述变化;而90 d,仅NALT和NP淋巴细胞出现上述同样变化。结论:两株双价痢疾菌苗滴鼻免疫小鼠后,能有效地诱导黏膜和系统免疫应答,且持续时间较长,但该免疫应答的减弱是从距免疫部位较远的部位而开始的。     

丙酮酸脱氢酶复合物X蛋白的原核表达与血清学鉴定

目的获得丙酮酸脱氢酶复合物的X蛋白(Pro-X)的原核表达蛋白.方法采用RT-PCR技术从人淋巴细胞RNA中扩增出Pro-X的基因片段,克隆至pET28a( )表达载体进行诱导表达,并对表达产物进行Western blot和ELISA鉴定.结果成功构建了表达载体pET28a( )/Pro-X;表达产物能特异性的被原发性胆汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis,PBC)患者血清中的抗线粒体抗体识别.结论获得Pro-X蛋白的原核高效表达,为利用原核表达的丙酮酸复合物对PBC患者进行血清学检测进一步奠定了基础.