甲基化特异性PCR检测PRAME基因启动子低甲基化30例及其临床应用

目的 建立实时定量甲基化特异性PCR(RQ-MSP)法检测急性髓系白血病(AML)患者黑色素瘤优先表达的抗原(PRAME)基因低甲基化水平,初步评价其临床意义.方法 用亚硫酸氢盐修饰后的基因组DNA为模板,建立EvaGreen染料法RQ-MSP检测PRAME基因低甲基化水平方法,检测18例(对照组)和30例(AML组)患者的骨髓单个核细胞中PRAME基因启动子低甲基化水平.结果 RQ-MSP融解曲线呈单一峰,标准品 5×107～5×102 copy/μL重复性良好;AML患者PRAME基因低甲基化水平(0.96～4 508.96,中位772.42)明显高于对照组(0～100.00,中位25.29),差异有统计学意义(P＝0.002).结论 建立的PRAME基因低甲基化RQ-MSP法特异性、重复性和灵敏性良好,可用于AML初诊和病情监测.     

建立高分辨熔解曲线分析法检测SF3B1基因突变

目的:建立高分辨熔解曲线分析法(high-resolution melting analysis,HRMA),检测骨髓增生异常综合征(my-elodysplastic syndrome,MDS)患者中SF3B1基因的突变。方法:针对SF3B1基因热点突变位点(密码子E622、H662、K666和K700)设计PCR扩增引物,建立带有温度内标校准品的PCR扩增反应体系,对30例初诊MDS患者的骨髓标本进行PCR扩增,应用HRMA对相应PCR产物进行突变检测,并对HRMA检测结果进行DNA测序验证。结果:HR-MA检测发现2例MDS患者存在异常的熔解曲线,经DNA测序验证1例为K666M杂合子突变,另1例为K700E杂合子突变。所建立的HRMA技术检测SF3B1基因突变的灵敏度为0.05(5%)。结论:成功建立检测SF3B1基因突变的HRMA技术,可快速筛查MDS标本中的SF3B1基因突变。     

死亡相关蛋白激酶基因启动子甲基化特异性PCR法的建立与初步应用

目的:建立甲基化特异性PCR(MSP)技术检测死亡相关蛋白激酶(DAPK)基因启动子甲基化.方法:设计针对DAPK基冈启动子的MSP引物,建立MSP检测体系对甲基化阳性模板进行检测,评价其特异性、重复性和灵敏性,并经测序鉴定.结果:所建市的甲基化MSP方法仅能扩增出甲基化阳性模板.不能扩增出未甲基化阳性模板和未硫化处理的DNA模板;对不同梯度稀释的甲基化阳性模板进行检测,其最大敏感性可达2%;在不同时间进行甲基化MSP检测的结果均一致.结论:成功建立的DAPK基因启动子甲基化MSP检测方法具有良好的特异性、灵敏性和重复性,可用于肿瘤标本的批量检测.     

建立PCR-高分辨率熔解曲线分析法检测淋巴瘤MYD88基因突变

髓系分化起始反应基因88(MYD88)位于染色体3p22,编码蛋白为Toll样受体(TLR)信号传导途径中的一个重要接头分子,结构上主要包括2个功能域:N端的死亡域(DD)和C端的Toll域(TIR),在天然免疫应答和炎症反应中发挥着重要的调控作用[1-2].最近的研究发现39%活化B细胞(ABC)型弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)患者中存在MYD88基因的获得性突变[3],其中位于TIR域的L265P突变发生率最高(29%).高分辨率熔解曲线分析(High resolution melting curve analysis,HRMA)是一种新型的突变分析技术,具有灵敏度高、特异性好、成本低廉、高通量检测的优点,已在临床上得到越来越多的应用[4].我们拟建立HRMA法对MYD88 L265P突变进行检测.     

56例巨幼细胞性贫血临床实验室特点分析

目的分析巨幼细胞性贫血（megaloblasticanemia,MA）患者的临床及实验室指标并探讨其临床意义。方法对56例巨幼细胞性贫血患者的临床和肝功能、心肌酶谱、血象和血清造血原料等实验室指标进行回顾性分析。结果56例患者中48例（85．7％）维生素B12缺乏、5例（8．9％）叶酸缺乏;51例（91．1％）出现贫血伴白细胞和（或）血小板减少,3l例（55％）平均红细胞体积（MCV）大于120fL;与正常对照相比,MA患者中乳酸脱氢酶（LDH）、α-羟丁酸脱氢酶（HBDH）、门冬氨酸氨基转移酶（AST）、总胆红素（TBIL）和间接胆红素（IBIL）明显增高,差异有高度显著性（P〈0．01）。结论LDH、HBDH、AST、TBIL和IBIL增高可作为巨幼细胞性贫血的临床实验室诊断的重要参考指标。     

EvaGreen实时定量PCR检测急性髓系白血病GRAF基因表达

目的 研究急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)中粘着斑激酶相关性鸟苷三磷酸酶调节因子(GTPase regulator associated with the focal adhesion kinase,GRAF)基因的表达及其临床意义.方法 建立EvaGreen染料法实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative PCR,RQ-PCR),对71例AML患者和21例良性血液病患者中GRAF转录本水平进行检测,分析其临床相关性.结果 所建立的EvaGreen RQ-PCR方法具有良好的特异性、重复性,敏感度达102拷贝/μL.AML患者中GRAF转录本水平(0.01%～169.75%,中位3.82%)较对照组(14.49%～126.85%,中位56.04%)显著降低(P<0.05),GRAF基因表达量与患者性别、年龄、外周血白细胞计数、血红蛋白、血小板计数、FAB亚型、染色体核型分组均无相关性(P>0.05).结论 AML患者中GRAF基因表达下调,可能与其发病有关.     

高分辨熔解曲线分析法检测急性髓细胞白血病IDH2基因突变

目的建立高分辨熔解曲线分析(HRMA)技术检测急性髓细胞白血病(AML)中可溶性异柠檬酸脱氢酶2(IDH2)基因突变。方法针对IDH2突变位点设计PCR扩增引物,建立带有温度内标校准品的PCR扩增体系,对98例AML患者标本进行PCR扩增,用HRMA技术对PCR产物进行突变分析,并通过DNA测序技术对HRMA结果进行验证。结果对98例AML样本的PCR产物进行HRMA检测,发现5例存在异常熔解曲线,对此5例标本及随机选择的HRMA显示为野生型的35例IDH2标本进行DNA测序验证,结果表明,存在异常熔解曲线的5例标本为4例R140Q突变和1例R172K突变,其余35例经DNA测序证实为野生型IDH2;对不同浓度梯度的R140Q质粒HRMA检测结果表明其灵敏度为2%。结论成功建立HRMA技术检测IDH2突变,其可用于AML标本的临床检测。     

EvaGreen染料法实时定量PCR检测急性髓系白血病PRAME基因转录本

目的:采用实时定量聚合酶链反应(RQ-PCR)法检测急性髓系白血病(AML)中黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)基因转录本,初步评价其在AML中的临床意义. 方法:设计PRAME基因引物,建立扩增PRAME基因转录本的EvaGreen染料法RQ-PCR法,对PRAME转录本克隆质粒进行扩增,评价其特异性、重复性和灵敏性.并对10例AML患者的骨髓单个核细胞标本进行初步检测. 结果:所建立的EvaGreen RQ-PCR法具有良好的特异性,最低可检测到10个拷贝/μl的阳性模板,但其重复性差,而108～102拷贝/μl阳模的重复性良好.10例初诊AML患者PRAME转录本绝对含量为4.91×102～8.07×105拷贝/50ng(中位7.26×103拷贝/50ng),ABL标化后的相对含量为4.42%～13 170.01%(中位67.98%).而对照组8例缺铁性贫血患者中PRAME转录本相对含量为 0.00%～0.01% (中位0).1例AML患者诱导缓解后PRAME转录本下降,复发时又明显升高.结论: EvaGreen染料法RQ-PCR检测PRAME转录本方法敏感可靠,可用于AML患者临床监测.     

急性髓系白血病患者dapk基因启动子甲基化改变的研究

本研究旨在分析中国人群急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)患者死亡相关蛋白激酶(deathassociated protein kinase,DAPK)基因启动子的甲基化状况及其临床相关性。应用甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MSP)技术对112例AML患者骨髓标本dapk基因甲基化状态进行检测。结果表明:13例对照组均未发生dapk基因启动子甲基化,而112例AML患者中82例(73.2%)发生dapk基因甲基化,dapk基因甲基化改变与患者的性别、年龄、白细胞、血红蛋白、血小板计数、AML分型以及染色体异常等结果均无相关性(p0.05)。结论:dapk基因甲基化是AML中的一个常见分子事件。