腺病毒介导转化生长因子β1基因阻逆兔椎间盘退行性变的实验

目的:观察腺病毒载体搭载的人转化生长因子基因对兔椎间盘退行性变模型的治疗作用。方法:实验于2003-03/2004-09在协和医院骨科实验室进行。取4个月龄健康雌性日本大白兔30只,于协和医院骨科实验室行L4～5,L5～6前外侧纤维环损伤手术以构建椎间盘退行性变模型。术后8周将动物随机分入3组。治疗组14只,注射20μL(10×106pfu)腺病毒载体介导人转化生长因子β1基因;对照组8只,注射20μL(10×106pfu)腺病毒载体介导标志基因(Ad/CMV-LacZ);空白组6只,注射20μL生理盐水。另取2只同类的健康白兔作为正常对照,不予任何手术或治疗。注射后3周取各组椎间盘组织行苏木精-伊红染色、T2加权磁共振成像、蛋白免疫印迹、转化生长因子β1免疫组织化学观察。结果:①兔椎间盘组织切片观察结果:注射3周后,治疗组切口已基本愈合,髓核细胞大量增生;空白组纤维环外侧内2/3部分仍未愈合,部分髓核细胞坏死、凋亡;对照组较空白组改善不明显。②MRI扫描结果:治疗组椎间盘信号较对照组及空白组有所恢复,但并未完全达到正常椎间盘水平。③蛋白质免疫印迹分析结果:治疗组转化生长因子β1含量较对照组和空白组有显著上升(P<0.01)。④转化生长因子β1免疫组织分析结果:治疗组转化生长因子β1为强阳性表达(>50%),空白组几乎没有转化生长因子β1表达,对照组与空白组相似。治疗组显著高于对照组(χ2=20.563,P=0.00)。结论:腺病毒载体介导人转化生长因子β1基因转染退行性变的椎间盘细胞能够有效提高髓核细胞内转化生长因子β1含量,阻逆椎间盘退行性变。     

单启动子双表达载体pIRES-p14ARF-p53的构建及对骨肉瘤细胞增殖的抑制

背景：以往的研究表明，ADp14ARF转染p53阳性的肿瘤细胞系，可以发现明显的细胞增殖受阻现象。而转染p53阴性的肿瘤细胞系，尽管也可见肿瘤细胞增殖受阻，但在程度上明显轻于前者。同时转染p14ARF和p53两种基因，既增强p53表达又加强p53积累，能否更易促进肿瘤细胞凋亡？目的：利用基因工程技术构建双质粒表达载体pIRES-p14ARF-p53，并观察其对骨肉瘤细胞增殖生长的抑制作用。设计：随机对照观察。单位：华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科。材料：实验于2005—01／2006—10于华中科技大学同济医学院基础医学院免疫教研室公共实验平台完成。人骨肉瘤MG-63细胞有华中科技大学同济医学院免疫教研室细胞室提供。含p53全长基因序列的质粒pIRES-p53和pIRES载体均购自武汉晶赛生物公司。方法：利用基因工程技术，将从培养的正常人肝细胞系L02细胞中扩增出的p14cDNA（0．5kb）亚克隆至pIRES载体中，通过PCR、限制性内切酶酶切鉴定重组质粒pIRES-p14ARF-p53。通过脂质体介导转染入骨肉瘤MG-63细胞中，并筛选出阳性克隆，将细胞分为3组：空白对照组（MG-63细胞），空载体对照组（稳定转染pIRES-neo细胞），p14ARF-p53组（稳定转染pIRES-p14ARF-p53细胞）。①采用流式细胞仪测定转染前后瘤细胞DNA含量和细胞周期。②逆转录PCR（RT-PCR）和Westem bolt对稳定转染后的瘤细胞p53、p14ARF蛋白的表达进行定性和半定量检测。③采用噻唑蓝比色法与细胞生长曲线观察细胞增殖情况。主要观察指标：①骨肉瘤细胞DNA含量和细胞周期。②瘤细胞p53、p14ARF蛋白的表达。③细胞增殖情况。结果：成功构建出双质粒表达载体pIRES-p14ARF-p53。①骨肉瘤细胞DNA含量和细胞周期：流式细胞仪检测发现转染后的瘤细胞多停滞于G1期。②蛋白表达检测结果：RT-PCR与Western blot检测证实p14ARF、p53基因在靶细胞mRNA和蛋白水平分别有独立表达。③细胞生长情况：转染MG-63后24，48，72，96h瘤细胞生长抑制率分别为33．43％、69．37％、66．19％、75．26％，与空载体对照组差异显著（P〈0．01）。结论：野生型p53和p14ARF可协同抑制骨肉瘤细胞的增殖促进瘤细胞的凋亡。     

中华长城椎弓根螺钉系统对胸腰椎骨折后脊髓功能的恢复作用

目的 观察中华长城椎弓根螺钉系统(China Great-Wall Spinal System)在胸腰椎爆裂性骨折中的应用效果，以探讨其对骨折后脊髓功能的恢复作用。方法 采用中华长城椎弓根螺钉系统治疗胸腰椎爆裂性骨折18例，并用X线检查评估Cobb角、椎体成角、上下终板成角椎体前缘高度。结果 术后及随访期同拍X片测定Cobb角(由术前平均7．8&;#176;到术后平均1．3&;#176;)、椎体成角(由术前平均-17．2&;#176;到术后平均-3．2&;#176;)、上下终板成角(由术前平均-15．6&;#176;到术后平均3．9&;#176;)、椎体前缘高度与正常高度的比值均明显改善，随访期间测量以上结果与术后相比无明显变化。最后一次随访按Frankel分级评估，4例A级Frankel分级无改变，其余均改善1～2级。3例C级和4例D级恢复到E级，2例B级和3例C级恢复到D级。1例B级恢复到C级，1例A级恢复到B级，4例A级Frankel分级无改变，但感觉平面有所下降。结论 中华长城椎弓根螺钉系统(CGWS)能有效减轻胸腰骨折后的脊椎移位，促进脊髓功能的恢复。     

中华长城椎弓根螺钉系统对胸腰椎骨折后脊髓功能的恢复作用

目的观察中华长城椎弓根螺钉系统(ChinaGreat-WallSpinaSystem)在胸腰椎爆裂性骨折中的应用效果,以探讨其对骨折后脊髓功能的恢复作用。方法采用中华长城椎弓根螺钉系统治疗胸腰椎爆裂性骨折18例,并用X线检查评估Cobb角、椎体成角、上下终板成角椎体前缘高度。结果术后及随访期间拍X片测定Cobb角(由术前平均7.8°到术后平均1.3°)、椎体成角(由术前平均-17.2°到术后平均-3.2°)、上下终板成角(由术前平均-15.6°到术后平均3.9°)、椎体前缘高度与正常高度的比值均明显改善,随访期间测量以上结果与术后相比无明显变化。最后一次随访按Frankel分级评估,4例A级Frankel分级无改变,其余均改善1～2级。3例C级和4例D级恢复到E级,2例B级和3例C级恢复到D级,1例B级恢复到C级,1例A级恢复到级,4例A级Frankel分级无改变,但感觉平面有所下降。结论中华长城椎弓根螺钉系统(CGWS)能有效减轻胸腰骨折后的脊椎移位,促进脊髓功能的恢复。     

经皮椎间孔镜技术治疗腰椎间盘突出症的临床疗效

目的探讨经皮椎间孔镜技术治疗腰椎间盘突出症的临床疗效。方法60例腰椎间盘突出症患者随机分为两组各30例,对照组给予椎板开窗术治疗,观察组给予经皮椎间孔镜技术治疗,比较两组的手术指标、疼痛VAS评分、功能障碍ODI评分以及手术优良率。结果观察组的切口长度、术中出血量、手术时间及住院时间均显著优于对照组(P<0.05)。观察组患者术后的VAS评分及ODI评分显著低于对照组(P<0.05)。观察组的手术优良率为96.67%,显著高于对照组的76.67%(P<0.05)。结论经皮椎间孔镜技术治疗腰椎间盘突出症的效果显著,创伤小,术中出血量少,住院时间短。     

福氏志贺菌5a型M90T株GAPDH蛋白多克隆抗体的制备和鉴定

目的制备高效的福氏志贺菌5a M90T3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)的多克隆抗体,并对其特异性进行评价。方法提取M90T的全基因组,采用PCR法扩增M90T中的基因gapA克隆到原核表达载体pET-24中,重组质粒转入到大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,条件优化后纯化GAPDH-His融合蛋白。以纯化的融合蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠,制备该蛋白的多克隆抗体。Western blot法、ELISA鉴定获得的抗血清。结果成功构建了原核表达载体pET24a-gapA,通过一系列诱导条件的优化,确定可溶性条件为30℃、1 mmol/L IPTG诱导2 h。用纯化的融合蛋白GAPDH-His作为抗原免疫小鼠制备多克隆抗体,Western blot法、ELISA证明多克隆抗体制备成功。结论成功制备了福氏志贺菌5a M90T特异性的小鼠多克隆抗体。     

志贺菌福氏5a M90T热休克蛋白70(DnaK)多克隆抗体的制备和鉴定

目的制备小鼠抗志贺菌福氏5a M90T热休克蛋白70(Dna K)的多克隆抗体,并鉴定其特异性和效价。方法 PCR扩增M90T中的基因dna K插入到原核表达载体p ET-24a中,获得p ET24a-dna K重组质粒,然后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中表达,通过亲和柱纯化融合蛋白Dna K-His。将纯化的融合蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠,采集抗血清。用免疫印迹法、ELISA和免疫荧光技术鉴定抗血清的特异性和效价。结果重组质粒p ET24a-dna K在大肠杆菌BL21(DE3)中可以高效表达。用纯化的融合蛋白Dna K-His免疫小鼠制备得到的多克隆抗体能特异性低检测志贺菌福氏5a M90T Dna K蛋白,能有效地用于免疫印迹法、ELISA和免疫荧光等试验。结论成功制备了抗志贺菌福氏5a M90T Dna K蛋白的小鼠多克隆抗体。     

脊髓造影辅助经皮椎板间孔内窥镜下髓核摘除术治疗L5/S1椎间盘突出症

目的:评估术中脊髓造影辅助经皮椎板间孔入路内窥镜下髓核摘除术治疗L<,5>/S<,1>椎间盘突出症的临床价值.方法:选择确诊为L5/S1单节段腰椎间盘突出症患者共40例,采用随机数字表的方法将患者分为A组和B组,每组各20例.A组在脊髓造影辅助下行经皮椎板间孔入路内窥镜下髓核摘除术,B组不实施脊髓造影操作,其它方法同A组.记录两组穿刺到目标椎间盘所需时间,一次性穿刺成功率,穿刺过程中神经根刺激症状和神经根、硬膜囊损伤发生率,脊髓造影相关的并发症.两组病例均随访6～12个月.采用疼痛VAS评分、Oswestry功能障碍指数(ODI)、改良的MacNab分级标准为疗效观察指标.结果:A组穿刺到目标椎间盘时间为9.67±1.45min,B组14.40±2.35min(P<0.01);A组一次性穿刺成功率95%(19/20例),B组60%(12/20例)(P<0.05);A组穿刺过程中神经根刺激症状发生率15%(3/20例),B组55%(11/20例)(P<0.05);A组无神经根和硬膜囊损伤发生,B组神经根和硬膜囊损伤各1例.按照改良MacNab疗效评定标准,A组优良率85%,B组优良率80%,两组无显著性差异(P>0.05).两组患者术后VAS和ODI评分较术前明显改善(P<0.05),但两组间比较无差异(P>0.05).A组中未见和脊髓造影相关并发症发生.结论:脊髓造影辅助经皮椎板间孔入路内窥镜下髓核摘除术治疗L<,5>/S<,1>椎间盘突出症的优点是减少目标椎间盘的穿刺时间,提高一次性穿刺成功率,降低并发症的发生率.     

鞘内药物输注系统永久植入术治疗顽固性疼痛病人18例

鞘内药物输注系统(IDDS)永久植入术治疗顽固性疼痛病人18例,其中晚期癌痛病人13例,非癌痛病人5例.首先行筛选试验,随后行IDDS永久植入术.癌痛病人采用视觉模拟评分(VAS评分)及QLQ-C30生活质量评分(QLQ-C30)法,非癌痛病人采用VAS评分法,评价疼痛程度,记录副作用及并发症的发生情况,癌痛病人随访至死亡,非癌痛病人均获得随访至今.术后所有病人经短期鞘内给药量调整后,VAS评分降低,癌痛病人QLQ-C30评分升高.部分病人出现恶心呕吐、便秘、尿潴留、皮肤瘙痒、镇静过度等,约1周均明显缓解,无持续残留症状.术中拔除穿刺针时误割断鞘内导管1例;导管与泵的金属接口过度磨擦至导管破裂,出现渗液1例;术后出现低颅压2例,脑脊液渗漏1例,右小腿后外侧持续性神经病理性疼痛1例,无伤口感染、裂开、愈合不良,无导管渗漏、破裂、异位、折叠、被结扎或肉芽肿形成,无泵翻转、位置异常等,设备本身无故障出现.

Abstract：

From November 2003 to May 2010, intrathecal drug delivery system (IDDS) was implanted in 18 patients with chronic intractable pain. Analgesia was provided with morphine. Thirteen patients suffered from late stage cancer and 5 from diseases other than cancer. VAS score was used to measure intensity of pain in all 18patients. QLQ-C30 score was used to evaluate quality of life in cancer patients. The patients were followed up for 3-62 months in 5 non-cancer patients. All 13 cancer patients died at 57 days-10 months after operation. VAS scores were significantly decreased and QLQ-C30 scores increased by intrathecal administration of morphine. Side effects developed in all patients to some extent including nausea, vomiting, constipation, urinary retention, pruritus and over-sedation and vanished in a week. Intrathecal catheter was cut while being pulled out of the needle in 1 patient. Two patients developed low intracranial pressure after operation. Cerebrospinal fluid leakage occurred in 1 patient. One patient developed neuropathic pain in the posterolateral side of right leg.     

p16ink4a/hRb1对骨肉瘤细胞周期协同的调控作用

目的 观察外源性p16ink4a／hRb1基因联合导入骨肉瘤细胞后，对其细胞周期的协同调控作用。方法 利用本室构建的pIRES-p16ink4a-hRb1、pIRES-p16ink4a与pIRES-hRb1质粒，脂质体介导转染p16缺失，hRb1表达阳性的骨肉瘤细胞株MG63，G418筛选获得抗性克隆，通过逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blot半定量分析外源基因表达；SubG1法流式细胞术分析细胞周期特异性和凋亡率，噻唑蓝（MTT）比色法与细胞生长曲线观察细胞增殖情况。结果 外源基因在靶细胞mRNA和蛋白水平分别有独立表达。与对照组比，所有外源性基因导入组细胞周期均显著阻滞在G1期（P〈0．01）并存在凋亡，且双基因导入组凋亡率分别比单基因组高4．04和6．94倍（P〈0．01）；所有外源性基因导入组各时间点细胞生长抑制率均显著上升，且双基因导入组细胞高于单基因组（P〈0．01）。结论 p16ink4a／hRb1联合导入骨肉瘤细胞后，干扰了p16ink4a-CyclinD1／CDK-hRb1负反馈循环，比单基因导入更能抑制肿瘤细胞生长和杀灭肿瘤细胞。