单侧延长臂分子信标探针芯片在结核杆菌检测中的运用研究

目的分子信标探针在芯片表面的固定结合是限制其在芯片技术领域运用的难题。本研究拟寻找一种将分子信标探针固定在芯片表面的新方法,同时对其中重要影响因素进行优化探讨。方法本实验设计一种带单侧延长臂分子信标探针,固定在芯片表面进行杂交、扫描等后续实验。提高杂交效率部分优化包括：分子信标探针浓度;杂交温度、杂交时间;杂交液配方;4种分子对分子信标荧光信号比较。结果较理想区分阴阳性信号强度理想的探针浓度：Cy3-BDH分子信标探针浓度约10μmol/L,FAM-DABCLYE约15μmol/L。讨论单侧延长臂分子信标特异性高、敏感性高、技术难度低,对中、高密度芯片杂交可做到“点对点杂交”。     

检测结核分枝杆菌rpoB基因突变的研究

目的：建立聚合酶链反应－单链构象多态性（PCR－SSCP）检测结核分枝杆菌rpoB基因突变的方法，并评价共临床应用的价值。方法：依据结核分枝杆菌rpoB基因的耐利福平决定区设计引物，用PCR从临床分离株和直接从痰标本中扩增rpoB基因片段；对扩得的rpoB基因片段做DNA SSCP分析，并随机测定rpoB片段的序列。结果：PCR从所有212株结核分枝杆菌中均扩得230bp片段135份抗酸染色阳性的痰标本中，有113份扩得阳性片段（83．7％），在SSCP分析中，140份经L－J药敏试验检测为利福平耐受的结核分枝杆菌，有130份有rpoB基因突变（符合率为92．9％），72份经L－J药敏试验检测为利福平敏感的菌，有67份的rpoB基因无突变（符合率为93．1％），测序分析发现57份经SSCP检测为突变的rpoB片段均有序列改变，10份经SSCP分析为无突变的有8份无序列改变，SSCP与测序结果的符合率为94．0％，在本研究的菌株中，耐多药结核病（MDR－TB）占76．4％（107／140），有92．5％（99／107）耐多药菌株经SSCP检测有rpoB突变。结论：建立的PCR－SSCP分析方法，是一种较准确和稳定的检测结核分枝杆菌rpoB基因突变的方法，可用于临床快速分析患者结核分枝杆菌对利福平的耐药性，并可作为MDR－TB判断的一个重要指标。     

三种方法用于耐多药肺结核患者菌种初步鉴定的比较分析

目的分析临床分枝杆菌培养阳性的耐多药肺结核患者三种初步鉴定结核菌种方法的准确度,期望为临床结核病实验室初步菌种鉴定技术的有效运用提供参考。方法收集重庆市公共卫生医疗救治中心结核内科2013年7月15日至2014年1月14日期间162例临床明确诊断为耐多药肺结核患者的实验室检查数据,统计三种方法(方法一:噻吩-2-羧酸肼(TCH)和对硝基苯甲酸(PNB)试验方法二:胶体金法定性检测MPB64抗原,方法三:分枝杆菌分型鉴定)菌种初步鉴定结果,分析检测结果的敏感性,采用卡方检验,以P0.05为差异,具有统计学意义。结果以临床诊断结果为标准,三种方法鉴定结核分枝杆菌的敏感性,为93.8%(152/162),95.7%(155/162),96.3%(156/162)(P0.05)。以方法三为标准,方法一和方法二鉴定结核分枝杆菌的敏感性分别为93.8%(150/156),95.7%(154/156)(P0.01);鉴定非结核分枝杆菌的敏感性分别为50%(1/2),100%(2/2)。结论三种方法均可用于耐多药肺结核患者菌种的初步鉴定,使用胶体金法定性检测MPB64抗原法更方便、更省时。     

结核分枝杆菌胶体金法快速鉴别试剂盒的临床应用观察

目前,传统的分枝杆菌菌种鉴定方法需在改良罗氏L-J培养基、硝基苯甲酸PNB和2-噻吩羧酸肼(TCH)鉴别培养基上初步鉴定结核分枝杆菌(MTb)和非结核分枝杆菌(MOTT)后,再观察细菌菌落形态、生长速度、生长温度和色素,并进行一系列生化试验,操作繁琐、费时,影响因素多;其他,如BACTEC-TB系统的NAP试验和Gen-Probe系统的结核分枝杆菌直接检测(MTD)试验等也可快速鉴别结核分枝杆菌复合群(MTC)和MOTT,但试剂仪器价格昂贵,难以在普通实验室广泛开展。     

重庆地区耐多药结核分枝杆菌基因分型特征分析

目的 对重庆地区耐多药结核患者结核分枝杆菌进行基因分型,明确该地区基因类型的特征和流行情况.方法 连续收集重庆市公共卫生医疗救治中心和重庆市第十二人民医院结核内科2013年7月至2015年3月753例临床诊断为耐多药结核患者的痰液或其他体液,采用液体培养法分离培养分枝杆菌,采用PCR方法对分枝杆菌分离株进行菌种鉴定,并使用多位点数目可变串联重复序列分析(multiple locus variable number of tandem repeat analysis,MLVA)方法进行基因分型.采用Bionumerics Version 3.0和phyloviz软件进行各基因位点的多态性和成簇分析.结果 共分离培养出538例耐多药分枝杆菌菌株,经PCR鉴定确认结核分枝杆菌有503例(95.8％),非结核分枝杆菌有35例(4.2％).北京家族型470例(93.4％,470/503),非北京家族型33例(6.6％,33/503).503例分枝杆菌菌株共分为348个基因型,其中267例患者分离株为单一基因型,其余236例菌株可归入81个簇,成簇率为30.8％.北京家族型有76个簇,成簇率为30.8％,成簇比例为35.9％,非北京家族型有5个簇,成簇率为30.3％,成簇比例为33.3％.不同特征的耐多药结核人群对结核分枝杆菌北京基因型菌株易感因素分析:感染北京基因型菌株与性别无显著性关联(x2=2.68,P ＞0.05);与年龄呈显著性关联(x2 =784.00,P＜0.05).结论 重庆地区耐多药结核分枝杆菌的基因型存在明显的多态性,北京基因型占绝对优势;不同特征耐多药结核人群感染北京基因型菌株与性别无关,与年龄相关.     

耐异烟肼结核杆菌KatG463condon点突变的分子信标快速检测

目的应用分子信标探针检测结核杆菌耐异烟肼kat G463condon点突变,并与测序结果比较以验证该检测方法。方法运用软件对Beacondesigner设计,katG基因包含463condon的分子信标,建立其扩增体系及分子信标芯片检测方法;对扩增产物测序并作比较。结果通过CDC相机观测到结核标准株及耐异烟肼PCR产物与分子信标杂交后荧光信号区别明显;16株耐异烟肼组与10株H37RV标准株对照组荧光信号强度比较,耐异烟肼组463condon突变检出率为37％,分子信标检测方法与测序法符合率达93％。结论分子信标技术是一种具有高灵敏核酸点突变检测技术;分子信标芯片检测方法与测序法符合率较好。     

依赖利福平结核分支杆菌在无利福平条件下的生长情况研究

目的 探讨依赖利福平结核分支杆菌（依R菌）在无R条件下的生长情况。方法 取初步研究的典型依R菌株，挑取最佳R浓度管中的单个菌落，制备10^-4mg/ml菌液，分别接种于L－J和12B液体培养基，37℃培养；对比观察不同试验管细菌的生长速度、特点以及光镜、电镜下的菌体形态。结果 L－J培养有R管2周可见菌落，无R管3周才见到细小菌落；12B液体培养，前者9天获得阳性指数，后者需13天。有R管中菌落生长粗大、凸起、花菜样、易刮取和乳化；无R管中菌落生长细小、扁平、荷包蛋样、不易刮取和乳化。光镜下有R管菌体粗大、深染；无R管菌体细小、浅染，且大小不等。透射电镜下有R管菌体细胞壁完整，无R管菌体细胞壁缺陷。结论 依R菌在无R条件下可呈细胞L型样改变。     

希腊人HLA-A和B抗原与肺结核相关

本文探讨人类白细胞抗原(HLA)系统与肺结核病发病机理的关系。作者对57例希腊成人肺结核患者进行了研究.所有病例均经细菌学证实。用Bethesda 国家卫生学会(NIH)提供的57例(男37,女20)肺结核病人(年龄20～78岁)抗血清,用标准NIH 微淋巴细胞毒性试验检测HLA-A 和B 抗原的类型,并以400例同样群体的健康人作为对照组。实验结果表明,具有HLA-B_(27)抗原的患者16例(28%),其检出率显     

结核分枝杆菌Rv0341蛋白编码基因iniB的多态性分析

目的研究结核分枝杆菌假设蛋白Rv0341编码基因iniB的多态性,确认其保守性,分析依赖利福平结核分枝杆菌(依R菌)在利福平(R)培养管中Rv0341高表达的可能原因。方法用大肠埃希菌做为阴性对照,提取依R菌(14株)、耐R菌(23株)、R敏感的结核分枝杆菌(12株)、结核分枝杆菌标准株H37Rv及BCG(共51株)的细菌基因组DNA,利用PCR自基因组DNA中扩增iniB基因,通过ApaⅠ/EcoRⅤ、KpnⅠ/SmaⅠ双酶切,琼脂糖凝胶电泳检测其带型,对iniB基因进行限制性片段长度多态性分析并测序。结果实验组中iniB基因的酶切图谱完全相同,测序结果亦证实iniB基因无突变。结论 iniB基因在对R依赖、耐药和敏感等不同类型的结核分枝杆菌中是相对保守的;依R菌在Rv0341蛋白表达方面的差异可能是RNA转录差异或利福平诱导的结果。     

43例肺科病人痰BACTEC法培养结核分枝菌时污染菌种的分析

目的：探讨肺科病人痰BACTEC法培养污染菌种分布特点，以期更好地控制污染，降低污染率，方法：对1997年10月至1999年1月收治的650例肺科病人痰标本BACTEC法培养污染标本，用常规普通细菌培养鉴定方法进行分离鉴定，并对结果进行分析，结果：650例肺科病人痰BACTEC法培养标本中，污染43例，总污染率为6．6％（43／650），对43例污染标本进行普通细菌培养鉴定，共分离出12种菌株，其中4例培养出2－3种菌株，共得48 ，以枯草杆菌和微球菌为主，分别为16株（33．3％），9株（18．8％），另外，还分离出金黄色葡萄球菌6株（12．5％），白色念珠菌3株（6．2％），以及革兰阴性杆菌14株（29．2％），且分为7种细菌，结论（1）实验室污染仍为主要污染源，应加强严格的无菌操作。（2）革兰阴性杆菌、金黄色葡萄球菌及白色念珠菌共占到47．95（23／48），提示与肺部感染及口咽部病原菌污染有关，建议临床加强肺部炎症控制。