检测结核分枝杆菌rpoB基因突变的研究

目的：建立聚合酶链反应－单链构象多态性（PCR－SSCP）检测结核分枝杆菌rpoB基因突变的方法，并评价共临床应用的价值。方法：依据结核分枝杆菌rpoB基因的耐利福平决定区设计引物，用PCR从临床分离株和直接从痰标本中扩增rpoB基因片段；对扩得的rpoB基因片段做DNA SSCP分析，并随机测定rpoB片段的序列。结果：PCR从所有212株结核分枝杆菌中均扩得230bp片段135份抗酸染色阳性的痰标本中，有113份扩得阳性片段（83．7％），在SSCP分析中，140份经L－J药敏试验检测为利福平耐受的结核分枝杆菌，有130份有rpoB基因突变（符合率为92．9％），72份经L－J药敏试验检测为利福平敏感的菌，有67份的rpoB基因无突变（符合率为93．1％），测序分析发现57份经SSCP检测为突变的rpoB片段均有序列改变，10份经SSCP分析为无突变的有8份无序列改变，SSCP与测序结果的符合率为94．0％，在本研究的菌株中，耐多药结核病（MDR－TB）占76．4％（107／140），有92．5％（99／107）耐多药菌株经SSCP检测有rpoB突变。结论：建立的PCR－SSCP分析方法，是一种较准确和稳定的检测结核分枝杆菌rpoB基因突变的方法，可用于临床快速分析患者结核分枝杆菌对利福平的耐药性，并可作为MDR－TB判断的一个重要指标。     

黑龙江立克次体外膜蛋白B基因表达及表达重组蛋白的抗原性分析

黑龙江立克次体为远东蜱传斑点热病原体,本文以黑龙江立克次体基因组为模板,扩增ompB的4段基因,利用原核表达载体构建重组表达质粒,IPTG诱导重组质粒转化的大肠杆菌表达重组目的蛋白,并对其抗原性进行分析.免疫印迹反应表明,重组表达的4个蛋白均与黑龙江立克次体感染小鼠血清反应.该4个重组蛋白分别免疫小鼠后,分析其血清的特...     

分支杆菌分子分型及鉴定的研究进展

分支杆菌属于裂殖菌纲、放线菌目、分支杆菌科、分支杆菌属。分支杆菌种类繁多，有报道分支杆菌已达150种以上。分支杆菌属分为结核分支杆菌复合群[(mycobacteria tuberculosis complex，MTC)，包括结核分支杆菌、牛分支杆菌、非洲分支杆菌、田鼠分支杆菌]、麻风分支杆菌以及非结核分支杆菌(nontuber—     

贝氏柯克斯体重组膜蛋白抗原激活树突状细胞诱导特异性免疫应答

目的分析贝氏柯克斯体(Coxiella burnetii,Cb)膜蛋白抗原对树突状细胞(dendritic cells,DCs)的激活作用,筛选能有效激活DCs的蛋白抗原,探讨该蛋白抗原间接激活T细胞的作用。方法从健康成年人外周血中分离单核细胞,加入GM-CSF和IL-4体外培养单核细胞成未成熟DCs;分别用Cb的5种重组膜蛋白IcmO、EnhA、SecB、Lo1A、HspB刺激DCs;用流式细胞仪(fluorescence activated cell sorter,FACS)检测刺激后DCs表面分子表达。结果 SecB刺激的DCs表达CD83,CD86,CD80,CD54,CD58,和CD40水平显著高于其它4种蛋白;将SecB激活DCs或SecB激活DCs培养上清刺激T淋巴细胞,FACS检测显示刺激后CD4+和CD8+细胞高水平表达的T淋巴细胞活化标志CD69以及细胞因子IFN-γ和TNF-α。结论 SecB膜蛋白抗原能有效激活DCs和它所激活DCs能够诱导特异性细胞免疫应答,为贝氏柯克斯体潜在保护性抗原。     

黑龙江立克次体感染血管内皮细胞的初步研究

目的 通过黑龙江立克次体感染体外培养人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells, HUVEC）探讨其在内皮细胞内的生长规律。方法 将泛影葡胺密度梯度超速离心纯化的黑龙江立克次体（HLJ-054株）感染体外培养的HUVEC,通过间接免疫荧光和扫描电镜检测与观察不同时相黑龙江立克次体在内皮细胞内的生长状况。热灭活黑龙江立克次体做平行对照。 结果 立克次体粘附并侵入内皮细胞,在感染后第6h及第24h分别为感染高峰;感染5 d后细胞内立克次体逐渐增殖,第8～9d细胞内立克次体急剧增殖,并见细胞核内有少量立克次体,细胞出现病变,第12d细胞内充满立克次体,大部分细胞皱缩脱落。结论 黑龙江立克次体能够感染血管内皮细胞,在血管内皮细胞内不断增殖而使细胞死亡。     

贝氏柯克斯体热休克蛋白B基因的克隆与表达

目的克隆贝氏柯克斯体(Coxiellaburnetii)热休克蛋白B(HspB)基因并在大肠杆菌细胞内高效表达。方法采用PCR方法,从贝氏柯克斯体新桥株基因组DNA中扩增出HspB的基因片段,鉴定后将目的片段与原核表达载体pQE30连接,构建重组表达质粒pQE30/hspB,IPTG诱导该重组质粒转化的大肠杆菌产生HspB重组蛋白。结果(1)PCR扩增获得长约1556bp的hspB基因片段。(2)SDS-PAGE证明,HspB重组蛋白的分子量为53.7kDa。(3)经薄层扫描分析,表达蛋白约占全菌体蛋白的71.2%。结论贝氏柯克斯体hspB基因在大肠杆菌中获得了高效表达,为Q热疫苗的研制提供了一易于获得的候选蛋白分子。     

实时荧光定量PCR检测恙虫病东方体

目的建立检测恙虫病东方体的实时荧光定量PCR(quantitative real-ti me PCR)方法。方法根据恙虫病东方体56kD外膜蛋白基因序列设计引物和探针,以克隆的56kD基因片段作DNA模板,建立实时荧光定量PCR检测方法。结果建立的荧光定量PCR标准曲线的循环阈值(Ct)与模板拷贝数呈良好的线性关系(r=0.999)。荧光定量PCR检测恙虫病东方体的灵敏度约为套式PCR的100倍,并且具有良好的重复性。用该定量PCR检测其它相关立克次体和病原菌DNA样本,检出结果均为0。用该定量PCR检测恙虫病东方体实验感染小鼠的血、脾脏、肺脏、肝脏标本,结果脾脏中东方体出现最早和检出量最多,肝脏和肺脏次之。血中的恙虫病东方体量较低。结论本研究建立的荧光定量PCR方法具有很高的特异性和敏感性,可用于东方体感染早期血样本的快速检测作恙虫病感染早期诊断,并且可以定量分析评价恙虫病东方体感染的程度。     

氯仿-甲醇提取贝氏柯克斯体残存组分Q热疫苗的免疫原性及免疫保护性研究

目的实验评价氯仿-甲醇提取贝氏柯克斯体残存组分(CMR)疫苗的免疫特性及免疫保护性。方法采用国内分离贝氏柯克斯体新桥株制备CMR疫苗,用CMR免疫Balb/c小鼠;采用间接免疫荧光法检测CMR免疫小鼠血清特异性抗体水平和用淋巴细胞增殖试验评价CMR疫苗体外刺激小鼠脾细胞增殖的能力;以贝氏柯克斯体攻击免疫小鼠和用贝氏柯克斯体特异的荧光定量PCR检测感染小鼠血和脾脏样本。结果CMR免疫第4周起,小鼠血清中检出高水平的特异性抗体,CMR加氢氧化铝佐剂免疫小鼠的血清特异性抗体显著高于未加佐剂组。CMR在体外刺激正常小鼠和免疫小鼠脾淋巴细胞增殖水平显著高于对照组,WCV则抑制正常脾淋巴细胞增殖。三种剂量(30μg、10μg、1μg/只)CMR免疫小鼠血和脾脏样本贝氏柯克斯体含量显著低于未免疫组,以30μg组及加佐剂免疫小鼠的样本含菌量更显著低于对照组。结论采用我国分离株制备的CMR疫苗能诱导机体产生高效特异性体液免疫和细胞免疫应答,使机体抵抗大剂量的贝氏柯克斯体感染,具有良好的免疫原性和免疫保护性;氢氧化铝佐剂能显著增强CMR疫苗的免疫保护效能。     

贝氏柯克斯体新桥株刺激人树突状细胞的表型分析

目的树突状细胞(dendritic cell,DC)具有成熟与未成熟两种形态,前者是早期免疫应答强有力的抗原呈递细胞,后者能诱导免疫耐受。分析贝氏柯克斯体(Coxiella burnetii,Cb)、Cb脂多糖(LPS)、去除LPS的Cb对DC的激活作用,探讨Cb逃逸宿主免疫清除的机理。方法从健康成年人的外周血中分离单核细胞,加入GM-CSF和IL-4体外培养单核细胞成未成熟DC;分别用灭活Cb、Cb LPS、去LPS Cb刺激体外培养未成熟DC,大肠杆菌LPS作为阳性对照刺激因子;刺激后24h,用流式细胞仪(fluorescence activated cell sorter,FACS)检测DC表面分子:成熟标记分子CD83与共刺激分子CD40、CD58、CD80、CD86。结果去LPS Cb刺激DC表面分子表达水平与大肠杆菌LPS刺激最相近,显著强于未刺激DC,而灭活Cb、Cb LPS刺激DC表面分子CD83、CD40、CD80、CD86的表达在一低水平。结论LPS遮盖了Cb激活DC所需的表面分子,除去LPS后暴露的分子与DC相互作用,对DC的成熟刺激作用显著高于灭活Cb、Cb LPS的刺激作用。LPS的存在有利于贝氏柯克斯体逃逸宿主的免疫清除。     

伯氏考克斯体新桥株感染BALB/c小鼠的实验研究

目的:分析伯氏考克斯体新桥株对BALB/c小鼠的感染性.方法:用伯氏考克斯体新桥株腹腔接种感染小鼠,于感染后7,14,21,28 d分别处死小鼠,采用伯氏考克斯体特异的荧光定量PCR检测感染小鼠肝、脾、肺组织样本中伯氏考克斯体含量.采用间接免疫荧光法检测感染小鼠血清特异性抗体水平.结果:感染后28 d内,小鼠肝、脾、肺组织中均检出大量伯氏考克斯体,第7天检出量最高,脾的含量显著高于肝和肺,肝的含量显著高于肺.随着感染时间延长,伯氏考克斯体检出量呈下降趋势,但血清特异性抗体水平则不断升高.结论:伯氏考克斯体新桥株为强毒株,可以引起BALB/c小鼠较长时间的稳定感染;BALB/c小鼠可以用作伯氏考克斯体感染模型.