疟原虫纯化新方法的研究

目的：拟应用去白细胞输血器,建立一种快速简便纯化疟原虫的新方法,以去除宿主白细胞DNA干扰。方法：建立Pb ANKA株鼠疟模型;39只小鼠分为A组（新鲜虫血组,n=18）、B组（冻存虫血组,-80℃保存,n=16）及C组（正常对照组,n=5）;应用去白细胞输血器对血样进行过滤纯化,观察比较过滤速度及血样处理（新鲜、冻存）对去除白细胞效果的影响;血细胞计数板和血涂片吉姆萨染色法计数各样本过滤前后白细胞、红细胞、原虫率并观察疟原虫形态和疟原虫密度。滤过后的血液提取DNA,PCR验证白细胞滤过效果。结果：经血细胞计数板计数,3组白细胞平均去除率比较,差异无统计学意义（P〉0.05）;C组红细胞的回收率高于A组,差异具有统计学意义（P〈0.05）;B组则仅见原虫。白细胞过滤后疟原虫形态及密度无明显改变。PCR鉴定PbGAPDH结果 A、B组均为阳性,而小鼠GAPDH均为阴性。结论：建立了白细胞输血器一步法纯化疟原虫的新方法。该方法简便、快速、廉价,是进行疟原虫分子生物学、免疫学等方面的研究不可或缺的实用技术。     

ITS结合RPS0两步PCR快速鉴定临床5种假丝酵母菌

目的:建立快速准确鉴定常见假丝酵母菌种类的基因检测技术。方法:提取假丝酵母菌基因组DNA;第一步PCR用通用引物扩增ITS基因;第二步三重PCR用种特异性引物扩增RPS0基因;分别对已知及未知样本检测、验证。结果:ITS基因扩增,光滑假丝酵母菌(Cg)和克柔假丝酵母菌(Ck)分别得到与预期结果吻合的881bp和419bp的PCR产物;白假丝酵母菌(Ca)、热带假丝酵母菌(Ct)和近平滑假丝酵母菌(Cp)的ITS扩增片段均略大于500bp;RPS0三重PCR对Ca、Ct和Cp DNA扩增,分别得到约310bp、147bp及110bp的片段,与预期结果相符;30株已知假丝酵母菌两步PCR检测结果,种类符合率为100%;43株未知样本两步PCR鉴定结果,经RPS0扩增产物序列测定,符合率亦为100%。结论:建立了ITS通用基因结合RPS0种特异基因鉴定5种常见假丝酵母菌种类的两步PCR技术,该技术简单、快速、准确及廉价;对双重感染患者更有鉴别优势,有临床应用价值。     

伯氏疟原虫哌喹抗性系的建立及其抗性表型特征观察

目的:建立伯氏疟原虫(P.b.)抗哌喹(PQR)系鼠疟模型;比较其抗性表型基本特征.方法:采用鼠-鼠间血传、药物剂量递增法对P.b.ANKA哌喹敏感株(PQS)进行抗性培育,通过测定PQS ED50和PQR ED50计算抗性指数及抗性稳定性;显微镜观察虫体形态变化、计数原虫率,记录分析小鼠接种后存活时间及肝、脾及体重变...     

某校园环境中烟曲霉菌的分离及CSP分型鉴定

目的通过采集某校园环境标本,分离、鉴定出烟曲霉菌并对其进行分型研究,了解该校园环境中烟曲霉菌基因型及其分布情况。方法釆集该校内土壤、腐叶来源样本进行培养,10%KOH染色及乳酸棉兰染色,显微镜下观察;提取基因组DNA并扩增β-微管蛋白(β-tubulin)基因以鉴定烟曲霉菌,利用烟曲霉细胞表面蛋白(CSP)对其进行分型。结果从土壤、腐叶各20份共40份样本中共分离到43株真菌,其中土壤样本中分离到19株,腐叶样本中分离到24株;经β-tubulin基因PCR扩增鉴定,22株为烟曲霉菌,包括土壤来源的8株和腐叶来源的14株;所获的烟曲霉菌经CSP基因扩增及序列测定,分为2个基因型:t01型和t25型,其中t25型为新增CSP基因型。结论烟曲霉菌在环境中普遍存在,不同地区其烟曲霉菌种类存在差异,该研究中所发现的烟曲霉菌CSP基因型t25为新增型。     

TP63 rs6790167多态性与海南汉族人肺癌的相关性研究

  目的  探讨TP63 rs6790167多态性与海南汉族人肺癌之间的相关性。  方法  收集2014年6月至2015年7月258例海南医学院第二附属医院就诊的肺癌患者和270例健康对照者的外周静脉血,采用病例对照研究的方法,提取血液基因组DNA,应用等位基因特异性聚合酶链反应（allele-specific PCR,AS-PCR）法检测肺癌组和对照组人群的TP63 rs6790167位点的多态基因型。  结果  肺癌组中TP63 rs6790167位点的G等位基因分布频率明显高于对照组（P=0.045）。进一步分层分析显示,在肺腺癌组中,非吸烟男性的GG基因型分布和G等位基因的分布频率均显著高于对照组（P < 0.001,P=0.001）,携带GG基因型的非吸烟男性的肺腺癌发病风险与AA基因型相比明显升高（OR=6.66,95%CI为2.16~20.41）,相对于TP63 rs6790167位点的A等位基因,携带G等位基因的非吸烟男性的肺腺癌发病风险显著增加（OR=2.54,95%CI为1.42~4.56）。  结论  TP63 rs6790167多态性与肺腺癌的发生有关,对非吸烟男性人群肺腺癌的发生可能具有预测作用。      

AS-PCR方法检测中国人群CYP2C19基因多态性

目的:建立一种快速、灵敏的细胞色素氧化酶P4502C19基因多态性检测方法。方法:分离外周血淋巴细胞基因组DNA,分别用一对等位基因特异性(allele-specific,AS)的反向引物与共用正向引物进行PCR扩增,通过电泳分析对应的PCR产物来判断CYP2C19基因型。在AS引物3′端倒数第三位或第二位引入错配碱基改进特异性。采用优化后方法对278例健康人进行CYP2C19基因型分析。结果:AS-PCR可检测CYP2C19基因多态性,引入第二个错配碱基可提高检测特异性。经直接测序验证结果完全一致。结论:建立和优化的AS-PCR方法适用于CYP2C19基因多态性快速检测。     

植物挥发油成分分析及抗假丝酵母菌活性的研究进展

侵袭性真菌感染是造成目前临床真菌感染的发病率和死亡率逐年上升的重要原因,其中以假丝酵母菌感染尤为严重。近年来主要的抗真菌药物均发现一定程度的毒副作用,由于临床上抗真菌药物的广泛使用造成耐药性日趋严重,因此迫切需要寻找安全有效的新型抗真菌药物。天然植物成分尤其是植物挥发油多具有抗菌消炎、解热镇痛、抗病毒等多种生物活性,其凭借来源广、低毒、广谱、作用途径多样化等优点成为了抗真菌药物研究开发的热点。植物挥发油的抗假丝酵母菌活性与其中成分及含量紧密相关。该文综述了近年来不同科属的植物挥发油的成分分析及抗假丝酵母菌活性研究,系统归纳总结了唇形科、樟科、桃金娘科等植物挥发油的提取、分析及抗假丝酵母菌活性的研究方法和结果,并对目前的研究方向进行了展望,以期为今后植物挥发油的成分分析和活性研究提供方向,为植物挥发油开发成为新的抗假丝酵母菌药物奠定理论基础,为真菌耐药问题造成的临床难题提供新的解决方案。     

临床患者口腔真菌的携带特征及其药敏检测

目的:通过对临床非真菌病患者口腔真菌的分离鉴定及其药敏检测,了解不同患者的真菌携带状况、种群分布及其对常用抗真菌药物的敏感性等,为临床防治真菌病提供参考依据。方法:对92例住院患者常规棉拭子口腔取材、真菌分离培养、科玛嘉显色法鉴定,分析不同疾病、年龄段患者假丝酵母菌的检出情况,并进行氟康唑、两性霉素B、酮康唑、氟胞嘧啶及伊曲康唑纸片法药敏测定。结果:92例样本经真菌培养,分离出53例(57.61%)假丝酵母菌;受检患者多以心脑血管疾病为主,其次为呼吸系统感染;60岁以上患者分离率(65.15%)显著高于60岁以下组(38.46%)(P<0.05);显色法鉴定白假丝酵母菌28例,热带假丝酵母菌8例,其它假丝酵母菌17例;所分离的真菌对5种药物均有不同程度的耐药性,其中对酮康唑的耐药性最高。结论:临床患者口腔黏膜真菌携带具有分离率高、年龄及病种相对集中的特征;菌群以白假丝酵母菌为主;分离株耐药性较普遍。     

伯氏疟原虫ANKA株抗哌喹系小鼠模型免疫学分析

目的观察伯氏疟原虫(Plasmodium berghei,Pb)ANKA抗哌喹(PQR)系小鼠模型的免疫学特征方法64只昆明小鼠随机分为3组,A组和C组各16只,B组32只(其中16只用于观察存活天数)。A组B组小鼠分别经腹腔感染伯氏疟原虫ANKA株哌喹敏感系(PbPQS)和抗性系(PbPQR)红内期原虫1×10~7个(200μl血),C组(健康对照组)注射等量生理盐水。每组于感染后4、8、12和16d各取4只小鼠,取尾血制薄血膜镜检,计算红细胞原虫感染率(简称原虫率)。脱颈处死小鼠,无菌取脾制备脾淋巴细胞悬液,用CCK-8法测定各组小鼠脾淋巴细胞经刀豆球蛋白A(ConA)刺激后的增殖反应,用Griess法和ELISA分别测定脾淋巴细胞培养上清中N0含量和γ干扰素(IFN-γ)水平。另取10只昆明小鼠,每鼠腹腔接种PbPQR系原虫约1×10~7个,待原虫率上升后下降,典型的原虫转变为蓝染细胞时,腹腔感染PbPQS系原虫(1×10~6个)进行攻击感染,观察小鼠原虫率和小鼠存活情况。结果 A组小鼠平均存活(9.0±3.0)d,感染后6～12d原虫率均>50%,出现严重贫血。感染后16d,B组小鼠全部存活,原虫率为(26.66±2.54)%。A、B两组小鼠的脾淋巴细胞经Con A刺激后增殖显著,感染后12d,分别为0.65±0.08和0.86±0.20(P<0.01)。脾淋巴细胞培养上清中,N0含量随感染时间延长而上升,感染后12d,A、B和C组分别为(48.80+3.49)、(54.80±2.17)和(7.80±0.71)μmol/L,三者比较差异有统计学意义(P<0.01)、A组脾淋巴细胞培养上清中IFN-γ水平随感染时间延长而上升,感染后12d达到最高,为(752.20+39.49)pg/ml,B组于感染后8d升至峰值[(855.80±33.65)pg/ml],感染后12d降至(620.20±27.11)pg/ml;感染后8d和12d,A组和B组IFN-γ水平的差异有统计学意义(P<0.01)。用PbPQS系攻击感染PbPQR系小鼠模型后10d,原虫率为(2.44±2.07)%,随之逐渐消失,感染后40d未检出虫体,无小鼠死亡。结论伯氏疟原虫ANKA株哌喹抗性系感染小鼠的脾淋巴细胞增殖水平、NO水平和IFN-γ含量均显著高于PbANKA株PQS系感染小鼠,可诱导小鼠产生一定保护性免疫反应。     

QPCR技术检测孕妇外周血中胎儿DNA方法的建立

目的:建立QPCR技术检测孕妇外周血中胎儿DNA的方法,并探讨其方法的稳定性、灵敏性与可靠性.方法:通过prime5.0设计出SRY与β-globin的TapMan探针,并对其QPCR反应体系进行优化.结果:分别得到了SRY与β-globin的引物及探针的反应最适浓度比,建立了其最佳QPCR反应体系,并得出所需外周血的最少量.结论:成功建立了QPCR技术检测孕妇外周血中胎儿DNA的方法,该方法将可用于无创性相关产前诊断.