大蒜新素对人巨细胞病毒感染的人胚肺成纤维细胞凋亡的影响

目的 研究大蒜新素对人巨细胞病毒(HCMV)诱导感染的人胚肺成纤维细胞(HELF)凋亡的动态变化及凋亡调控基因bcl-2和fas mRNA表达的影响。方法 用流式细胞术测定HELF在高、低感染复数(MOI分别为2．5、0．25)HCMV感染后1、12、24、36、48、72、96h凋亡细胞比率；大、中、小剂量大蒜新素(9、6和3μg／mL)处理正常的和感染的HELF细胞(MOI为2．5)后上述各时间点凋亡细胞比率。用原位杂交法检测大剂量大蒜新素处理感染细胞(MIO为0．25)72h后bcl-2和fas mRNA表达强度变化，并与正常细胞和感染细胞对比分析。结果 正常细胞凋亡比率保持恒定低水平(凋亡率平均2．68％)；低、高感染复数感染细胞随时间延长凋亡细胞逐渐增多，凋亡率峰值分别达8．85％(96h)和25．63％(72h)；各剂量大蒜新素处理的正常细胞凋亡率增加，呈剂量依赖性，峰值分别为4．88％、6．47％和8．35％；但各剂量药物处理感染细胞后却使细胞凋亡比率下降，大剂量药物处理72h时效应最为明显，凋亡细胞比率由25．63％降至16．24％。正常细胞高表达bcl-2，低表达fas基因；感染HCMV后，bcl-2表达显著下调，fas表达明显增强；大蒜新素处理感染细胞后使bcl-2表达强度明显高于感染细胞，fas表达水平明显低于感染细胞，但仍未恢复到正常细胞水平。结论HCMV是HELF凋亡的强诱导剂；病毒可通过下调凋亡抑制基因bcl-2和上调凋亡促进基因fas而发挥致凋亡作用。大蒜新素本身可诱导HELF凋亡，但却能明显抑制HCMV诱导的细胞凋亡，其抑制作用可能与药物干扰HCMV影响凋亡调控基因bcl-2和fas表达有关。     

人巨细胞病毒短时培养快速诊断改良技术的建立及其应用

目的 建立人巨细胞病毒（HCMV）短时培养快速诊断改良技术；检验临床样本，与病毒分离比较。方法 （1）用含细胞飞片培养板离心吸附AD169株，设时间梯度培养后用SABC法检测培养物中HCMV即刻早期抗原（IEA）；（2）用改良法检测156例患儿尿样本（7例留取脑脊液），其中54例与病毒分离对照；147例检测血清特异性IgM；（3）9例更昔洛韦（GCV）治疗后随访尿排毒和特异性IgM变化。结果 （1）标准毒株培养16－24h，能100％检出培养物中HCMV IEA。（2）快速法检测尿样本178份，阳性率46.6%。与病毒分离比较，敏感性和特异性分别达100％和91.7%。（3）147例检测血清HCMV IgM，50例阳性（34.0%），其中49例和另25例特异性IgM阴性者尿快速培养阳性，后25例中，年龄＜1岁22例；2例免疫抑制者快速培养阳性。（4）2例先天感染儿脑脊液快速培养阳性伴蛋白增高。（5）9例GCV治疗后随访2－4次，2例无效，1例尿排毒减少；6例尿排毒停止。结论 改良快速培养法敏感性高、特异性强，操作更为简便，是快速诊断活动性HCMV感染和评估抗HCMV疗效的可靠方法。     

用重组病毒株建立鼠巨细胞病毒性肝炎的实验模型

用插入LacZ基因的重组病毒株建立BALB/c小鼠巨细胞病毒 (murinecytomegalovirus ,mCMV)性肝炎模型。20只BALB/c甲基强的松龙免疫抑制小鼠 ,腹腔接种1×106PFU病毒悬液 ,动态观察血单个核细胞和组织中mCMV感染及肝组织病理变化。结果 :①mCMV感染小鼠血单个核细胞中X -gal染色阳性细胞在48h时开始出现 ,第3天有所减少 ,在第6天达到高峰;②肝、肺、肾组织病毒感染72h后可见 ,在第12天斑点数最多 ,以肝组织病毒感染多见;③肝组织病变在病毒感染后96h开始出现 ,在第12天达到高峰。提示 :利用重组mCMV建立的mCMV性肝炎小鼠模型 ,在感染后2周仍保持较高感染水平 ,为CMV的研究提供了一个良好的实验模型。     

实时定量PCR技术与短时培养法检测尿样本HCMV的比较

目的建立实时定量PCR系统定量检测尿样本中HCMV并与短时培养快速诊断半定量法比较。方法根据HCMVul123基因保守区设计特异性引物和taqman探针,以GAPDH为内参照校准所检测样本的细胞数,建立实时定量PCR检测系统,定量检测132份尿标本中HCMV拷贝数与短时培养结果比较,并同时分析19例接受更昔洛韦治疗前后尿排毒量的变化。结果132份尿标本实时定量PCR结果:短时培养(-)组HCMVDNA为(83±155)拷贝/5×105细胞(n=16例),( )组为(571±231)拷贝/5×105细胞(n=26例),( )组为(792±303)拷贝/5×105细胞(n=35例),( )组为(1126±416)拷贝/5×105细胞(n=16例),( )组为(2201±1043)拷贝/5×105细胞(n=9例);19例38份更昔洛韦治疗前后尿样本中3例治疗前后短时培养结果无改变,而实时定量结果明显改变。结论实时定量PCR法比短时培养法更适于评价抗病毒疗效,而短时培养法判断HCMV是否为活动感染优于实时定量PCR法。     

Effects of Human Cytomegalovirus Infection on Apoptosis and Expression of Apoptosis-Regulating Factors

Summary： The present study aimed to find out dynamic changes of apoptosis in human cytomegalovirus （HCMV） infected cells and the influence of HCMV infection on activation of caspase-3 and the expression of apoptosis-regulating genes, bcl-2 and fas mRNA. The sequential changes of apoptotic cell rate in high and low MOI （MOI=2.5 and 0.25 respectively） of HCMV infected human embryonic lung fibroblasts （HELFs） at 1 h, 12 h, 24 h, 36 h, 48 h, 72 h and 96 h post-infection were measured by flow cytometry. The expression levels of caspase-3 protein and bcl-2 and fas mRNA in HCMV infected cells （MOI=0.25） at 72 h post-infection were detected by Western blot and in situ hybridization methods, respectively. It was found that the ratio of apoptotic cells in normal controls was consistently lower, but the rates in low and high MOI infected cells were gradually increased with time prolonged, reached peak at 96 h （8.85 %） and 72 h （25.63 %）, respectively. By Western blot analysis, only a narrow band of 32 kD （1 kD=0. 992 1 ku） procaspase-3 was found in normal cells, but a wider procaspase-3 band and a much wider band of 17 kD proteins （p17） ap- peared in the infected cells. Meanwhile, the expression of bcl-2 mRNA was higher and that of fas mRNA was lower in the normal HELF cells, whereas there were significantly lower bcl-2 mRNA and higher fas mRNA expression levels in HCMV infected cells. It was concluded that HCMV was a stronger inducer of apoptosis in HELF cells. Caspase-3, as the marker of undergoing apoptosis, was expressed increasingly and activated in the infected cells, indicating its action in HCMV-inducing apoptosis. Down-regulating bcl-2 mRNA expression and up-regulating fas mRNA expression were also involved in the mechanism of HCMV-induced apoptosis.     

一种改良的小鼠原代肝细胞培养方法

为寻求一种简易、价廉的原代小鼠肝细胞培养方法 ,采用非灌注法、冰浴操作处理肝组织块及改良低血清培养基进行了原代鼠肝组织块和鼠肝细胞单层培养。通过光镜观察细胞形态、电镜观察超微结构及检测培养上清白蛋白水平证实培养细胞为肝细胞。持续培养结果显示原代培养第 6～ 12 d左右为肝细胞功能最佳观察和实验阶段。     

巨细胞病毒嗜肝细胞性和肝细胞感染模型的建立

目的确定巨细胞病毒（CMV）体外能否直接攻击肝细胞,并建立肝细胞感染模型。方法①人肝细胞系感染：用人CMV（HCMV）AD169毒株感染正常人肝细胞系（L-02）和人胚肺成纤维细胞（HELF）与L-02共培养细胞,HC-MV感染的HELF细胞为阳性对照;②原代鼠肝细胞（PML）感染：用重组鼠CMV（MCMV）感染PML细胞。光镜观察细胞病变（CPE）,电镜观察病毒颗粒,间接免疫荧光（IFA）法检测HCMV抗原;原位杂交法检测MCMVIE基因。PML性质经观察其特征性超微结构和检测培养上清白蛋白水平予以鉴定。结果在PML细胞纯度〉95%（培养第8天）时感染病毒,3d后〉80%细胞出现典型CPE;电镜下胞核和胞质内见大量病毒颗粒;病毒IE基因检测呈阳性。HELF细胞可被HCMV感染;而L-02细胞无论是单独,还是与HELF共培养,其病毒标志物均呈阴性,细胞结构保持正常。结论原代鼠肝细胞体外可受到MCMV直接感染,为CMV肝炎的体外研究提供成功的肝细胞感染模型;而正常人肝细胞系不能感染HCMV,推测其表面HCMV受体发生改变或丢失。     

改良脑脊液处理方法和优化PCR检测系统对结核性脑膜炎患儿的诊断价值

目的 改良脑脊液样本处理方法和优化PCR检测系统，提高结核性脑膜炎诊断阳性率。方法 建立微波-碱性非离子型表面活性剂-氯仿法，并用二甲基亚砜(DMSO)优化结核杆菌插入序列IS 6110 PCR检测系统；分别用微波-碱性非离子型表面活性剂-氯仿法和简易氯仿法处理1998年7月至2004年11月间华中科技大学同济医学院同济医院收集的108份脑脊液样本，经5%DMSO优化的PCR诊断系统扩增，将结果进行比较。结果 微波-碱性非离子型表面活性剂-氯仿法处理脑脊液模板PCR诊断结核性脑膜炎阳性率为88%，简易氯仿法为71%,假阳性率均为0。结论 微波-碱性非离子型表面活性剂 氯仿法和5%DMSO优化的IS 6110 PCR检测系统可有效提高结核性脑膜炎诊断的阳性率。 Abstract Objective To improve the diagnosing level of tuberculosis meningitis (TBM) by means of modified preparation of cerebrospinal fluid (CSF) and optimized IS6110 PCR system.Methods Establishing the modified template preparing method of microwave/ alkaline nonionic detergent/ chloroform and using dimethyl sulphoxide (DMSO) to optimize the PCR system of tubercle bacillus(TB) gene IS6110.Preparing the template from 108 CSF specimens with the microwave/alkaline nonionic detergent/ chloroform method and amplifying IS 6110 gene with DMSO modified system,comparing with the simple chloroform method.ResultsThe modified IS 6110 PCR assay with microwave/alkaline nonionic detergent/chloroform method showed the positive rate of 88%,while the rate of simple chloroform method was 71%.Both false positive rates were 0%. Conclusion The method of preparing the template with the microwave/alkaline nonionic detergent/chloroform method and modifying TB IS 6110 PCR system with 5%DMSO is an effective way to increase the positive rate of TBM diagnosis. Key words Tuberculosis meningitis;Cerebrospinal fluid;Dimethylul sphoxide;Polymerase chain reaction     

多重聚合酶链反应系统快速诊断结核和其他细菌感染

目的探讨多重聚合酶链反应(PCR)系统用于诊断细菌感染,并区分结核和其他细菌感染。方法多重PCR系统检测129份临床样本包括脑脊液108份、胸水10份、腹水11份,与培养结果比较,分别评估该系统检测普通细菌和结核杆菌敏感性和特异性。结果本系统检测临床样本中普通细菌和结核杆菌的敏感性均达100%,特异性分别为86%和81%。结论多重PCR系统可成功地用于临床快速诊断细菌感染,并有效区分结核和其他细菌感染。