IL-17 参与巨细胞病毒肝炎致病机制的研究

目的:在整体水平研究促炎细胞因子IL-17 在巨细胞病毒肝炎发病机制中的作用。方法:首先建立MCMV 全身播散性感染模型,设立正常对照组、MCMV 感染对照组、IL-17 阻断组和同型抗体对照组。在实验第7 天处死小鼠,Western blot 检测各组肝脏组织中IL-17 蛋白表达水平,病理评估各组肝组织损伤程度;罗氏生化分析仪检测小鼠血清ALT 水平;双抗体夹心ELISA 法检测血清中IL-17 水平; RT-PCR 检测肝脏组织内IL-17R、IFN-酌和IL-10 mRNA 的表达。结果:与MCMV 感染对照组及同型抗体对照组相比较,IL-17 抗体阻断肝脏组织IL-17 表达明显下降(P<0.05),病理损伤程度明显减轻,ALT 水平显著降低[ (146±15)vs (102±11)vs (37±12),P<0.05];血清中IL-17 水平降低[(719.76±6.06)vs (722.1±4.62) vs(707.53±8.58),P<0.05];IFN-γ[ (0.56±0.06)vs (0.55±0.13)vs (0.96±0.2),P<0.05] 与IL-10 mRNA[ (0.55±0.073)vs(0.51±0.07)vs(0.903±0.18),P<0.05]的表达明显增加,而IL-17R mRNA 表达差异无显著统计学意义[(0.81±0.16)vs(0.89±0.38)vs (0.870.23),P>0.05]。结论:促炎因子IL-17 高表达参与了巨细胞病毒肝炎的免疫损伤过程,阻断IL-17 有助于改善肝功能,减轻肝组织病理损伤。     

小鼠巨细胞病毒感染鼠胚胎成纤维细胞对共培养调节性T细胞增殖和活化的影响

目的 研究小鼠巨细胞病毒(MCMV)感染对共培养体系中调节性T细胞(Treg)的诱导作用和Treg在抗病毒免疫中的调节作用.方法 建立小鼠T淋巴细胞与感染CMV的同系小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)体外共培养的细胞模型.蚀斑法检测共培养上清液中MCMV负荷量;细胞计数法分析体系中T淋巴细胞的扩增;流式细胞术检测共培养体系中CD4+ CD25+ Treg细胞比例,Western印迹法检测T淋巴细胞中Foxp3蛋白表达强度;RT-PCR法检测MEF中转化生长因子(TGF)-β mRNA表达水平;双抗体夹心ELISA法检测细胞培养上清液中TGF-β蛋白表达水平.组间差异采用单因素方差分析.结果 T淋巴细胞与MCMV感染的MEF共培养1 d和3 d后,培养上清液中病毒负荷量较对照组显著减少;但是共培养6 d后,T淋巴细胞的免疫保护作用消失,病毒量为(5.58±0.67)×105 PFU/mL,与感染对照组的(6.05±0.34)×105 PFU/mL比较,差异无统计学意义.CMV感染3 d后,T淋巴细胞数由感染前的(2.02±0.05)×106 /mL 增至(2.25±0.13)×106 /mL (P＜0.05);但继续培养至6 d时,T淋巴细胞数为(2.08±0.14)× 106/mL,与3 d时比较,差异无统计学意义.CD4+ CD25+ Foxp3+ Treg细胞比例和Foxp3蛋白表达变化相似,均随MCMV感染时间延长而增加,在感染后6 d分别增至对照组的2倍和3倍;TGF-β在MEF中的基因转录水平(A值)由感染前的1.09±0.13增至感染3 d后的3.15±0.54,共培养上清液中的蛋白表达强度在感染后3 d增至(3.85±0.32)μg/L,与感染前的(1.74±0.14)μg/L比较,差异有统计学意义(P＜0.05).结论随感染时间延长,MCMV可能通过促进TGF-β表达等多种途径诱导Treg增殖活化.     

M122蛋白与宿主因子Myst4的相互作用位点

目的 明确M122蛋白与宿主因子Myst4相互作用的位点.方法 以诱饵载体pGBKT7-M122为模板,采用PCR方法扩增不同长度大小的M122基因片段,并将其分别插入至pMD-T simple载体,构建含有不同长度M122基因片段的重组质粒.将构建成功的各个重组质粒分别用限制性内切酶EcoRI和SalI进行双酶切鉴定,并送测序.将测序正确的重组质粒采用同样的内切酶进行双酶切,凝胶回收试剂盒回收不同长度大小的M122基因片段,并将其分别亚克隆至pGBKT7-BD载体构建含有不同长度M122基因片段的诱饵质粒.将构建成功的各个诱饵质粒分别用限制性内切酶EcoRI和SalI进行双酶切鉴定,并送测序.将测序正确的各个诱饵质粒分别与pGADT7 -Myst4质粒共同转化至酵母菌株AH109感受态细胞,转化后的酵母细胞分别涂板于营养缺陷培养基SD/-Trp/-Leu和SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-Gal平板.M122与宿主因子Myst4相互作用的位点通过营养缺陷筛选确定.结果 成功扩增了编码不同M122蛋白突变体的基因片段,并将其正确插入诱饵载体,构建了含有不同长度大小M122基因片段的诱饵质粒;通过酵母双杂交筛选明确了M122蛋白与宿主因子Myst4相互作用的结合位点位于M122蛋白的1～ 148氨基酸.结论 M122蛋白的1～ 148氨基酸是其与宿主因子Myst4相互作用所必需的,为研究M122蛋白在MCMV致神经系统损伤的分子机制中的作用提供了实验基础.     

ZAK-β蛋白激酶基因真核表达载体的构建

目的 将人源ZAK-β基因定向克隆入MSCV-IRES-GFP质粒,构建真核表达载体pMSCV-IRES-GFP-ZAK-β.方法 以肺癌A549细胞的cDNA为模板,通过PCR得到ZAK-β特异性基因产物,克隆入真核表达载体pMSCV-IRES-GFP中,获得重组真核表达载体pMSCV-IRES-GFP-ZAK-β,测序验证.结果 扩增了ZAK-β基因,经双酶切、测序鉴定证实目的基因克隆到真核表达载体pMSCV-IRES-GFP中,测序结果与预测完全一致.结论 成功构建了ZAK-β逆转录病毒表达载体,为进一步研究ZAK蛋白激酶的功能奠定了基础.     

胃转流术治疗53例肥胖型2型糖尿病的近期疗效分析

目的 研究胃转流术（Roux-en-Y gastric bypass,GBP）治疗肥胖型2型糖尿病的近期疗效.方法 对笔者所在医院2009年9月～2010年9月完成的53例胃转流术治疗肥胖型2型糖尿病患者的临床资料进行回顾性分析.结果 胃转流术治疗肥胖型2型糖尿病的总体有效率为90.6%.53例患者术后1个月的BMI指数均较术前有所降低,但差异无统计学意义（P＞0.05）.术后1个月空腹及餐后血糖较术前明显降低（P＜0.05）.术后糖尿病并发症明显减轻甚至消失.结论 胃转流术对肥胖型2型糖尿病具有安全有效的治疗作用,可明显减轻体重,并发症少,对于肥胖型2型糖尿病的治疗具有较好的应用前景.     

大蒜新素体内外抑制小鼠巨细胞病毒感染诱导的调节性T细胞扩增实验研究

目的 在体内外水平研究大蒜新素对小鼠巨细胞病毒 (murine cytomegalovirus, MCMV) 感染导致调节性 T 细胞 (regulatory T cells, Treg) 异常扩增的抑制作用。方法 72 只 MCMV 感染小鼠随机分为安慰剂组和大蒜新素治疗组;并设 72 只同期模拟感染小鼠为对照,随机分为模拟感染对照组和大蒜新素对照组。分别于大蒜新素处理后 1、7、14、28、60、120 d 处死小鼠,获得脾细胞待测。采用 Western blotting 法检测脾细胞中 Foxp3 的蛋白表达强度;流式细胞术分析 CD4+CD25+Foxp3+Treg 细胞在脾细胞中所占比率的变化。采用小鼠胚胎成纤维细胞对大蒜新素的最大耐受浓度处理 MCMV 感染的胚胎成纤维细胞 3 d 后,采用 Realtime PCR 法和 Western blotting 法分别检测 T 细胞中 Foxp3 mRNA 和蛋白的表达水平。结果 整体研究发现,大蒜新素对正常小鼠脾细胞中 Foxp3 蛋白表达和 Treg 细胞比率均无显著影响;但是在 MCMV 感染小鼠,大蒜新素可在感染慢性期显著减少 Foxp3 蛋白表达强度、降低调节性 T 细胞比率。体外细胞模型发现,最大耐受浓度的大蒜新素加入共培养体系后可部分拮抗 MCMV 诱导的 Foxp3 基因和蛋白表达上调。结论 大蒜新素在体内外均可显著纠正 MCMV 感染导致的 Treg 异常扩增。大蒜新素通过影响 Treg 增殖进而增强抗病毒免疫而有利于机体清除 CMV 病毒,可能是大蒜新素诱导抗 CMV 免疫的另一重要机制。     

13例溃疡性结肠炎外科治疗的体会

目的探讨溃疡性结肠炎的外科治疗方法。方法对13例外科治疗的溃疡性结肠炎的临床资料进行回顾性分析。结果13例患者中,6例全结直肠切除、回肠贮袋肛管吻合术（IPAA）,4例全结直肠切除、回肠肛管吻合术,3例全结直肠切除术、回肠造瘘术。结论积极早期的手术治疗能够根除疾病并消除癌变可能,IPAA是目前UC择期手术的患者较好的手术方式。     

成人Still病的淋巴结病理诊断及临床意义

目的 观察成人Still病（AOSD）的淋巴结病理形态特点,探讨其在AOSD诊断中的临床意义.方法 对浙江省桐乡市中医医院病理科收治的4例AOSD患者的临床资料进行回顾性分析,并对其淋巴结活检及免疫组化标记结果进行观察分析.结果 患者主要表现为体温升高、皮疹及关节痛等临床症状,肝脾及淋巴结肿大,外周血白细胞较正常水平升高,EB病毒,HIV及抗RNP抗体正常.患者淋巴结部分结构保存,副皮质区增宽,淋巴结主要呈增生性改变,增生细胞主要是免疫母细胞及Langerhans细胞,可见小淋巴细胞及组织细胞等散在分布,增生细胞核分裂象较多见,且异型性明显.免疫组化标记结果显示,免疫母细胞表达CD20及CD79α或表达CD3及CD45RO,Langerhans细胞胞质及胞核、高尔基区,CD1a和vementin胞质阳性,活化的淋巴细胞表达CD30,组织细胞表达CD68,CD15及ALK等均无表达.结论 AOSD临床诊断不依赖于淋巴结活检,但淋巴结活检对AOSD的诊断具有重要的辅助价值,且肿大的淋巴结的免疫反应特点对AOSD的鉴别诊断也具有重要意义.     

Clinical efficacy and safety of chelation treatment with typical penicillamine in cross combination with DMPS repeatedly for Wilson’s disease

The aim of this study was to assess the clinical efficacy and safety of chelation treatment with penicillamine （PCA） in cross combination with sodium 2, 3-dimercapto-l-propane sulfonate （DMPS） repeatedly in patients with Wilson＇s disease （WD）. Thirty-five patients with WD were enrolled. They were administrated intravenous DMPS in cross combination with oral PCA alternately which was practiced repeatedly, all with Zinc in the meantime. During the treatment, clinical observations and 24-h urine copper excretion as well as adverse effects of medicines were recorded and analyzed. Although the incidence of adverse effects was not significantly different after either intravenous DMPS or oral PCA treatment, levels of 24-h urine copper tended to be higher after short-term intravenous DMPS than that of oral PCA. Adverse effects in the course of intravenous DMPS were mainly neutropenia, thrombocy- topenia, allergic reaction and bleeding tendency. As compared with oral PCA alone or intravenous DMPS alone, such repeated cross combination treatment could as much as possible avoid continued drug adverse effects or poor curative effect and had less chance to stop treatment in WD patients. Im- proved or recovered liver fimction in 71% of the patients, alleviated neurologic symptoms in 50% of the patients, and disappeared hematuria in 70% of the patients could be observed during the follow-up pe- riod of 6 months to 5 years after such combined chelation regimen. Chelation treatment repeatedly with oral penicillamine in cross combination with intravenous DMPS alternately could be more beneficial for WD patients to relieve symptoms, avoid continued drug adverse effects and maitain lifelong therapy.     

柯萨奇病毒B_3感染小鼠脑组织的钙超载及N-甲基-D-天冬氨酸受体I型mRNA高表达

目的　为探索肠道病毒性脑炎的发病机制 ,以柯萨奇病毒 (CV)B3 感染小鼠 ,观察其神经细胞内钙离子 [Ca2 ]i及脑组织N 甲基 D 天冬氨酸受体I型 (NMDAR1)mRNA表达的变化。方法(1)取新生Balb/c小鼠大脑皮质神经细胞 ,培养 12d后 ,于CVB3 感染 12h(12份 )用流式细胞仪检测细胞内 [Ca2 ]i,并用原子吸收光谱法检测神经细胞培养上清液中游离钙Ca2 含量 ;(2 )以CVB3 颅内接种小鼠 ,用NMDAR1的cDNA地高辛标记探针对感染 3d后处死的石蜡包埋脑组织切片作原位杂交检测。结果　 (1)感染 12h小鼠脑神经细胞内 [Ca2 ]i值较对照组明显增高 (P <0 0 1)。感染组神经细胞培养上清液中Ca2 含量低于对照组 (P <0 0 1)。 (2 )感染组脑组织中NMDAR1mRNA表达明显高于对照组 (P <0 0 1)。结论　CVB3 感染小鼠脑神经细胞可导致细胞内 [Ca2 ]i超载 ,且与Ca2 内流有关。CVB3 感染又可引起小鼠脑组织NMDAR1mRNA表达增高 ,其结果可能进一步引起Ca2 内流和神经兴奋性毒性作用损伤脑组织