人SET基因小分子干扰RNA重组腺病毒载体的构建与鉴定

目的SET基因表达产物是SET／TAF-1β蛋白,功能涉及基因表达调控、染色质修饰、翻译后修饰等生物过程,多水平、多通路地调节靶因子,其表达异常与多种疾病相关。为研究SET基因与临床多种疾病发生发展的关系,文中构建表达人SET基因的小分子干扰RNA（siRNA）重组腺病毒载体。方法根据siRNA靶序列设计并合成2条互补的64 bp寡核苷酸。pShuttle-H1穿梭质粒经BglⅡ、HindⅢ双酶切后,与退火的寡核苷酸连接,构建穿梭质粒pShuttle-H1-siRNA。该穿梭质粒经Not Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切后与pAdTrack-CMV连接,构建含有绿色荧光蛋白（green fluorescense protein,GFP）报告基因的穿梭质粒PATC—H1-siRNA。分别将腺病毒骨架质粒pAdEasy-1和穿梭质粒PATC—H1-siRNA转化至BJ-5183感受态细菌中进行同源重组。Pac Ⅰ酶切线性化重组质粒pAd—H1-siRNA后,转染AD293细胞进行病毒包装和扩增。根据GFP报告基因的表达观察重组病毒的产生和感染效率,用Western blot检测人SET蛋白的表达水平。结果穿梭质粒pShuttle-H1-siRNA经双酶切和测序证实构建成功;重组腺病毒载体经AD293细胞包装后可观察到GFP表达;获得的重组腺病毒载体感染AD293细胞。经Western blot检测,SET基因腺病毒载体（AdH1-SiRNA／SET）感染组与未感染腺病毒载体组（空白对照）和感染对照腺病毒载体组（AdH1-SiRNA／NS）相比,SET蛋白表达水平显著降低（P〈0．05）,抑制效率为50％～70％。结论成功构建了表达人SET基因的siRNA重组腺病毒载体AdH1-siRNA／SET,并在AD293细胞中验证其抑制SET蛋白表达的作用,为进一步研究SET基因参与多种疾病的发生发展提供了材料。     

人SET基因重组腺病毒载体在小鼠颗粒细胞的表达

目的 以原代培养的小鼠卵巢颗粒细胞为模型,观察人SET基因重组腺病毒载体在卵巢颗粒细胞的感染效率和基因表达效果.方法 分离并培养小鼠颗粒细胞.扩增人SET基因重组腺病毒载体AdCMV-SET和对照重组腺病毒载体AdCMV,感染原代培养的小鼠颗粒细胞,通过观察绿色荧光蛋白(GFP)检测感染效率;qRT-PCR方法检测SET mRNA表达;Western blot方法检测SET蛋白的表达水平.结果 获得的重组腺病毒载体体外感染小鼠颗粒细胞,24 h观察到GFP表达.与AdCMV感染组相比,AdCMV-SET感染组SET mRNA表达水平显著增高(P＜0.05).与空白对照组(Mock)及感染AdCMV组相比,AdCMV-SET感染组SET蛋白水平显著增高(P＜0.05).结论 构建的人SET基因重组腺病毒载体能高效感染小鼠颗粒细胞、并有效表达,对细胞活率无影响.     

SET蛋白对精母细胞株(GC-2 spd)增殖和组蛋白乙酰化的影响

目的:观察SET蛋白对GC-2 spd精母细胞株增殖和组蛋白乙酰化的影响,探讨SET蛋白调节精子形成的作用。方法:体外培养GC-2 spd细胞,通过精母细胞标志物乳酸脱氢酶C(LDHC)和睾丸特异激酶1(TESK1)鉴定。琼脂糖珠免疫共沉淀试剂盒检测SET蛋白与组蛋白H4的结合。分别转染空载腺病毒(Ad H1-si RNA/NS,对照组)和SET干涉腺病毒(Ad H1-si RNA/SET,干涉组),比较细胞增殖情况,荧光显微镜观察GC-2spd细胞中SET蛋白的表达;用实时定量逆转录聚合酶链反应(Real time RT-PCR)和蛋白质印迹(Western blot)检测m RNA以及蛋白的表达。结果:免疫荧光显示精母细胞株GC-2 spd阳性表达LDHC和TESK1;SET蛋白表达于GC-2细胞的胞核和胞质中,免疫共沉淀提示SET蛋白与组蛋白H4结合。转染SET干涉腺病毒后,核内和胞质中SET蛋白表达明显降低(P0.01)。与对照组相比,干涉组细胞增殖明显降低,组蛋白H4乙酰化水平明显增高(P0.05);但组蛋白乙酰化酶(HATs)和去乙酰化酶(HDACs)m RNA表达水平差异无统计学意义(P0.05)。结论:精母细胞核内和胞浆中均表达SET蛋白;SET蛋白降调,则抑制GC-2spd细胞增殖。SET蛋白可能通过与组蛋白H4相互作用调节其乙酰化,参与调节精子形成。     

维生素D缺乏与多囊卵巢综合征发病机制的相关性研究

目的：探讨维生素D（vitamin D,VD）缺乏与多囊卵巢综合征（polycystic ovarian syndrome,PCOS）发病机制之间的关联。方法：检测34例PCOS患者和30例正常健康女性体内VD水平,并对其临床资料进行相关性分析;构建VD缺乏小鼠模型和 PCOS小鼠模型,分为正常对照组（control,CTR组）、PCOS组、VD缺乏组（VD^-组）、VD缺乏联合PCOS组（VD^- +PCOS组）。观察各组小鼠动情周期及卵巢形态改变;检测小鼠血清性激素指标、糖脂代谢指标;实时定量聚合酶链反应（real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR）法检测各组小鼠卵巢组织中激素合成酶及性激素受体mRNA表达水平。结果：PCOS女性体内25-羟维生素D［25-hydroxyvitamin D,25（OH）D］水平较正常健康女性明显降低［（16.49 ± 6.50）ng/mL vs.（20.08 ± 5.28）ng/mL, P=0.019］。PCOS组血清中黄体生成素（luteinizing hormone,LH）、睾酮（testosterone,TT）、黄体生成素与卵泡刺激素（follicular- stimulating hormone,FSH）比值即LH/FSH比值、游离雄激素指数（free androgen index,FAI）水平均明显高于对照组,性激素结合蛋白（sex hormone binding globulin,SHBG）水平明显低于对照组,差异均有统计学意义（P < 0.05）。相关性分析结果显示,总样本人群血清25（OH）D水平与LH（r=-0.271,P < 0.05）、LH/FSH 比值（r=-0.314,P < 0.05）、TT（r=-0.276,P < 0.05）、垂体泌乳素（prolactin,PRL）（r=-0.274,P < 0.05）、FAI（r=-0.312,P < 0.05）均呈负相关,PCOS 患者血清 25（OH）D 水平与PRL存在负相关（r=-0.404,P < 0.05）。VD缺乏使小鼠动情周期发生停滞;与CTR组相比,其余各组小鼠血清中LH水平明显升高 （P < 0.05）;与CTR组相比,VD^-组小鼠卵巢组织中雄激素受体（androgen receptor,AR）mRNA表达上调（P < 0.05）。结论：PCOS 患者存在VD缺乏现象,PCOS患者血清25（OH）D水平与PRL存在负相关关系。VD缺乏扰乱了小鼠正常动情周期并影响性激素水平,VD缺乏可能通过调节性激素受体表达来参与PCOS发生。     

SET/TAF-1β的研究进展

SET（patient SE translocation，SET）基因，又名模板活化因子-1（template activating factor，TAF-1），因首次鉴定于伴有该基因染色体异位的未分化型白血病患者SE而命名。SET蛋白具有多种生物功能，可以通过影响组蛋白乙酰化、转录调节、核小体装配等，参与基因表达调控、翻译后修饰、细胞凋亡等多个生物过程，是重要的细胞因子。一些消化和血液系统肿瘤、生殖与神经系统的疾病伴有SET表达或亚细胞定位异常，提示SET与这些疾病的发生发展相关。SET基因转录剪切产生TAX-Iα和SET／TA-1β2个亚型，而SET／TAF-1β可能发挥着SET蛋白的主要生物学作用。     

SET蛋白对精原细胞株GC-1spg增殖和凋亡的影响

目的探讨SET蛋白对精原细胞株GC-1spg增殖和凋亡的影响。方法使用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基在37℃、5%CO2条件下培养GC-1spg细胞,分对照组(转染无关序列腺病毒)和实验组[转染SET干涉腺病毒(AdH1-siRNA/SET)];GC-1spg接种于96孔板或者6孔板,转染腺病毒48h、72h后收集细胞,免疫荧光和共聚焦激光扫描显微镜检测SET蛋白在GC-1spg细胞中的表达与定位;提取细胞总蛋白,Western Blot检测转染前后SET蛋白的表达;细胞计数试剂盒-8(CCK8)和5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记法检测细胞的数目和增殖情况;流式细胞仪检测细胞凋亡的变化。结果 SET蛋白表达于GC-1spg细胞的胞核和胞浆中,且胞浆分布多于胞核;转染SET干涉腺病毒后,干涉组GC-1spg细胞中的SET蛋白相对表达量为(0.217±0.044)显著低于对照组的(0.629±0.170)(P0.05),同时GC-1spg细胞的数目减少,增殖减慢,且细胞凋亡率显著增加[干涉组(21.663±1.287)%,对照组(8.813±0.671)%](P均0.01)。结论SET蛋白在精原细胞GC-1spg胞核和胞浆中均有表达,且胞浆分布多于胞核;GC-1spg细胞中SET蛋白表达降低,能够抑制细胞增殖、促进细胞凋亡,提示SET蛋白可能参与调节精子发生的过程。     

微小RNAs与多囊卵巢综合征发病机制的研究进展

微小RNA(micro RNAs,mi RNAs)参与基因转录后表达调控。多囊卵巢综合征(PCOS)为一种异质性疾病,其发病机制尚不明确。多种mi RNAs在PCOS患者血清、颗粒细胞以及卵泡液中表达异常,提示mi RNAs参与PCOS的病理过程。mi RNAs与多种卵巢甾体激素的合成与分泌关系密切;参与卵泡的发育和闭锁,从而影响PCOS患者的排卵过程;还在胰岛素抵抗中发挥重要作用。mi R-125b、mi R-483和mi R-320通过调控多种靶基因而影响多条信号通路。综述mi RNAs在PCOS发病机制中的作用,一些功能比较明确的mi RNAs有望成为PCOS疾病诊断和预后评估的生物学标志物,为PCOS的治疗提供新思路。     

HPV-E7联合淋巴毒素免疫诱导的生殖道特异性免疫应答

目的 鼻腔免疫小鼠,诱导生殖道局部黏膜的特异性免疫应答.方法 将18只小鼠随机均分为三组:A组、B组小鼠鼻腔滴注人乳头瘤病毒(HPV) E7 10 μg,B组静脉注射淋巴毒素(LT)0.05 μg;C组用PBS作为对照.收集小鼠阴道冲洗液,ELISA测定HPV-E7特异性阴道IgA抗体滴度.在体内细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性分析实验中,用流式细胞仪检测靶细胞清除率.结果 A组阴道冲洗液中检测到HPV-E7特异性抗体滴度约为1∶20,高于B组的1∶40(P＜0.05).A组细胞杀伤率为(48.64±3.07)％,低于B组的(69.12±9.01)％(P＜0.05).结论 HPV-E7经鼻腔免疫小鼠后,可以使生殖道局部黏膜产生特异性体液和细胞免疫应答;LT则有效地提高了生殖道局部黏膜免疫应答效应.     

多囊卵巢综合征患者心理状况和生活质量的相关性

目的 研究影响多囊卵巢综合征（Polycystic Ovary Syndrome,PCOS）患者心理健康和生活质量的相关因素。方法 选取2020年05月～2022年06月在南京逸夫医院妇科门诊就诊的PCOS患者77例（PCOS组）,并选择同期体检的49例健康女性（对照组）。测量生化指标、填写临床资料问卷、贝克抑郁量表（Beck Depression Inventory-II,BDI-II）、广泛焦虑量表（Generalized Anxiety Disorder-7,GAD-7）、PCOS特异性生活质量量表（PCOS-specific QoL scale,PCOSQ）。通过Spearman相关性分析和回归分析,研究PCOS患者心理健康和生活质量的相关因素。结果 PCOS组较对照组情绪障碍发病率增高（OR=3.66,P<0.05）。PCOS患者的生活质量与游离睾酮指数（free androgen index,FAI）、体质指数（body mass index,BMI）、抑郁评分、焦虑评分成负相关（P<0.05）;多元线性回归显示游离雄激素指数（FAI）、抑郁评分是PCOS患者生...