流体力学方法转染IκBαSR对人肝癌裸鼠原位移植瘤的抑制

目的:使用流体力学方法向人肝癌裸鼠原位移植瘤转染含突变型IκBα的重组逆转录病毒质粒pBABE-puro-IκBα super repressor(pBABE-puro-IκBαSR),观察其对移植瘤生长的作用及其相关机制?方法:使用人肝癌细胞株MHCC97-H?MHCC97-L,建立裸鼠人肝癌原位移植瘤模型,将荷瘤鼠分为MHCC97-H组(对照组)?MHCC97-H+IκBαSR组(转染组)?MHCC97-L组(对照组)和MHCC97-L+IκBαSR组(转染组),1周后,使用流体力学方法通过尾静脉向对照组注射pBABE-puro空载体质粒,向转染组注射pBABE-puro-IκBαSR质粒?每周1次,共3次?观察荷瘤鼠的生存率,检测原位移植瘤块的大小?重量?以及转移瘤数目,使用全自动生化检测仪检测血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)?天门冬氨酸氨基转移酶(AST)水平?采用免疫组化SP法分析核因子(NF)-κB p65蛋白表达,使用Western blot检测总蛋白中IκBα蛋白含量?结果:pBABE-puro-IκBαSR质粒显著提高荷瘤小鼠的生存率,转染组肿瘤的体积?重量显著小于对照组,抑瘤率分别为29.3%和33.0%(均P < 0.05);转染组荷瘤小鼠ALT和AST显著低于对照组(均P < 0.05);NF-κB p65在对照组胞浆中及在细胞核中均呈强阳性表达,在转染组胞浆中呈浅棕色,为弱阳性表达,胞核中极少或没有阳性表达,差异具有统计学意义(P < 0.01)?Western blot结果显示,转染组IκBα表达水平高于对照组(P < 0.05)?结论:通过流体力学方法向人肝癌原位移植瘤转染突变型IκBαSR质粒,可以抑制移植瘤的生长?其机制可能是IκBαSR抑制了NF-κB的活化?     

变异链球菌核糖-5-磷酸异构酶A的表达、纯化与鉴定

目的在大肠杆菌中高效表达变异链球菌核糖-5-磷酸异构酶A(ribose 5-phosphate isomerase A,rpiA),并对表达产物进行纯化和鉴定。方法根据GenBank中变异链球菌UA159株基因组rpiA的DNA编码序列,设计PCR引物,扩增变异链球菌核糖-5-磷酸异构酶A的DNA编码序列,将其克隆至pGEX-6p-1载体中,构建重组质粒,将测序正确的重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导表达;对培养温度、IPTG用量、诱导时间等条件进行了优化;用亲和层析、离子交换层析纯化目标蛋白;用SDS-PAGE和质谱对目标蛋白进行鉴定。结果变异链球菌核糖-5-磷酸异构酶A在大肠杆菌中高效、可溶性表达,经质谱鉴定及SDS-PAGE分析,表达产物为变异链球菌核糖-5-磷酸异构酶A蛋白。经过纯化,得到纯度高达95%的变异链球菌核糖-5-磷酸异构酶A。结论成功地在大肠杆菌中高效表达了变异链球菌核糖-5-磷酸异构酶A蛋白,并建立了纯化工艺,得到高纯度的重组蛋白,为进一步研究变异链球菌属核糖-5-磷酸异构酶蛋白的生物学活性及功能奠定了基础。     

食管胃底静脉曲张出血合并早期食管癌内镜诊治一例

患者男,64岁,因“间断呕血、黑便10 d”于2015年1月1日收入我院。患者入院前10 d无明显诱因出现呕血,共1次,呈淡红色,量约300 mL;伴解黑便,1次／d。既往有40余年大量饮酒史,折合乙醇量约128 g／d。入院体检未见明显阳性体征。胸腹部CT示：食管上段管壁异常改变,肝硬化,脾大,食管胃底静脉曲张。血常规示：白细胞2.07×109／L,血红蛋白82 g／L,血小板83×109／L。肝功能示：丙氨酸氨基转移酶32 U／L,天门冬氨酸氨基转移酶53 U／L,白蛋白32.4 g／L,总胆红素19.7 μmol／L。2015年1月4日行胃镜检查示：① 食管距门齿18～23 cm环腔3／4周见不规则浅糜烂,覆污秽苔,质地脆,易出血;放大内镜联合窄带成像技术观察可见界限清晰的茶褐色区域,上皮乳头内毛细血管袢（IPCL）呈B1～B2型,可见无血管区域（AVA）＜0.5 mm;予1.2％卢戈液染色病变部位不着色,延迟观察可见粉红色征阳性。② 食管距门齿35 cm以下可见4条蓝色蚯蚓状曲张静脉,迂曲下行,延伸至贲门,直径约0.5 cm,无明显红色征,齿状线清晰。③ 胃底大弯侧见直径约2.0 cm不等团索状蓝色曲张静脉2条,红色征阳性。内镜超声示：食管上段糜烂处黏膜-黏膜肌层呈低回声增厚,黏膜下层回声分界尚清晰、连续,其余各层次回声分界清晰。活检病理示：高级别上皮内瘤变。术前诊断：早期食管癌,食管静脉曲张（Li,F2,D0.5,Rc-）,胃底静脉曲张（GOV-2）,酒精性肝硬化（失代偿期）。于2015年1月6日行食管静脉曲张硬化剂注射治疗+胃底静脉曲张组织粘合剂注射治疗。患者病情稳定后,于2015年1月13日行内镜下食管上段癌多环黏膜切除术（MBM）。术后病理示：食管鳞状上皮高级别上皮内瘤变（局部为原位癌）伴微浸润,基底部未见肿瘤。最终诊断：早期食管癌,食管静脉曲张（Li,F2,D0.5,Rc-）,胃底静脉曲张（GOV-2）,酒精性肝硬化（失代偿期）。术后患者发生食管狭窄,经6次内镜下食管狭窄扩张术治疗,并给予局部注射地塞米松5 mg及口服强的松（40 mg/d,每半月减0.5 mg直至停药）治疗后狭窄程度明显减轻。随访1年未再有出血,未见食管癌复发及新生食管胃底曲张静脉。诊疗过程见图1。     

血管紧张素(1～7)受体mas稳定转染细胞株的构建及mas激活对于ERK1/2信号通路的调节

背景:近几年有关mas基因与心血管疾病的关系成为研究的热点,但有关血管紧张素(1～7)-mas轴在调节心血管功能及在心血管疾病发病过程中发挥作用的信号转导途径还不甚清楚.目的:实验拟构建血管紧张素(1～7)受体mas稳定转染细胞株及mas基因表达和活化对ERK MAPK信号通路的影响.设计、时间及地点:重复测量设计,实验于2006-07/2008-03在首都医科大学生物化学与分子生物学实验室完成.材料:人mas全长cDNA,原核表达载体pEGFP C2,菌株E.coli DH5 α,COS-7细胞均由s本实验室保存.方法:将mas cDNA克隆到真核表达载体pEGFP C2中,构建重组质粒pEGFP-mas.再将重组质粒转染COS-7细胞,筛选稳定表达细胞株.主要观察指标:经血管紧张素(1～7)刺激后,检测稳定转染mas的COS-7细胞中ERK磷酸化水平变化.结果:与对照组相比,稳定转染mas的COS-7细胞经血管紧张素(1～7)刺激后,ERK磷酸化水平显著升高(P＜0.05).p-ERK水平在10 min内达到最高值,并且随着血管紧张素(1～7)浓度的增加(10-12～10-6mol/L),P-ERK水平逐渐升高.结论:成功构建mas稳定表达细胞模型,并显示出血管紧张素(1～7)受体mas活化可以引起下游ERK1/2信号通路的激活.     

低氧诱导人VEGF基因表达载体的构建及其蛋白表达检测

目的以人血管内皮细胞生长因子（hVEGF）基因的低氧反应元件（HRE）作为增强子,构建含HRE的真核表达载体,探讨含HRE不同拷贝数的载体对低氧的反应状态。方法将人工合成的HRE串联后与CMV启动子连接,替换pcDNA3.1的启动子部分,构建成低氧诱导真核表达载体;将hVEGF基因重组到此载体中,转染BHK细胞。用免疫组化染色法检测VEGF的表达,用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测低氧前后细胞hVEGF表达的变化。结果成功构建了含HRE的低氧诱导真核表达载体4HRE-pcDNA-VEGF和6HRE-pcDNA-VEGF。转染细胞后进行低氧培养,VEGF的表达均增高,含6HRE的低氧诱导作用高于4HRE。结论在含HRE的真核表达载体中,低氧时可诱导基因的表达,其拷贝数可影响诱导作用的强度。     

低氧诱导VEGF基因表达载体治疗家兔肢体缺血性疾病的实验研究

目的探讨低氧诱导血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)基因表达载体对家兔肢体缺血性模型的基因治疗效果。方法通过切除髂外动脉远端和股动脉分支制作家兔左后肢缺血模型,术后立即将含VEGF基因的低氧诱导表达载体6HRE-pcDNA-VEGF165多点注射至患侧肌肉内,并于不同时间点进行后肢胫动脉血压测量和动脉血管造影。结果与对照组相比,应用低氧诱导VEGF基因表达载体的基因治疗组胫动脉血压恢复快;动脉血管造影显示基因治疗组动脉充盈早于对照组,新生血管多于对照组,早于对照组建立侧支循环。结论低氧诱导VEGF基因表达载体可促进家兔肢体缺血模型新生血管的形成,改善缺血肢体的血液循环。     

四妙勇安汤对糖尿病大鼠肢体缺血治疗作用及其分子机制

目的研究四妙勇安汤对糖尿病后肢缺血大鼠的治疗作用及对丝苏氨酸蛋白激酶（Akt）、p38丝裂原活化蛋白激酶（P38）蛋白水平的影响。方法40只Wistar大鼠完全随机分为4组：对照组、对照治疗组建立单纯缺血模型;模型组、模型治疗组建立糖尿病肢体缺血模型,对照治疗组、模型治疗组给予四妙勇安汤治疗。分别于术前、术后即刻、术后第3、7、14天测下肢血流变化,术后15d取腓肠肌组织免疫组织化学CD31染色血管内皮细胞观察新生血管密度,及蛋白印迹法检测内皮细胞Akt、P38蛋白变化情况。结果模型组血管损伤严重,血管重建能力明显降低,第7天对照组、对照治疗组、模型组、模型治疗组血流比值为（45±4）、（49±3）、（364-3）、（48±6）％,第14天血流比值为（63±6）、（66±4）、（45±4）、（61±4）％,与模型组比较,其余3组差异均有统计学意义（P〈0．05）。模型组术后15d新生血管密度明显减低,Akt蛋白表达明显降低,P38表达明显升高,其他3组与其差异均有统计学意义（P〈0．05）;四妙勇安汤能够明显增加新生血管数量[模型组、模型治疗组分别为（9．1±2．0）、（16．4±2．9）个,P〈0．05,模型组、模型治疗组比值分别为（0．62±0．15）、（0．86±0．18）％,P〈0．05],增加Akt蛋白表达,降低P38表达,差异均有统计学意义[模型组与模型治疗组蛋白相对光密度比值：Akt：（0．20±0．07）、（0．28±0．56）％;P38：（1．18±0．23）、（0．99±0．04）％,P〈0．05],对照治疗组未发现中药治疗后副作用。结论四妙勇安汤能够改善糖尿病下肢缺血血运重建过程,加快血管新生速度,其作用机制可能是通过促进Akt表达,抑制P38表达实现的。     

IL-1α及ERα在HBV相关肝细胞肝癌中性别差异性的表达

目的 研究白细胞介素(IL) 1α在人类肝细胞肝癌(HCC)发生中的调节作用.方法 收集80例男性和36例女性患者乙型肝炎病毒(HBV)相关的HCC组织、相应的癌旁组织以及正常组织标本.用实时荧光定量PCR方法检测IL-1α、雌激素受体(ER)α、IL-6和MyD88的表达.同时检测二乙基亚硝胺(DEN)诱导的小鼠肝癌模型中IL-1α和IL-6的动态表达水平.结果 与正常组织比较,IL-1α在男性癌旁组织中高表达,ERα在男性HCC患者的肿瘤和癌旁组织中都有明显的减少.并且在男性的癌旁组织中,IL-1α的增加和ERα表达的减少之间存在线性相关(r=-0.61,P ＜0.01).在DEN诱导的小鼠肝癌模型中,IL-1α在新生肿瘤中高表达,并随着HCC的发生发展而逐渐减少.结论 IL-1α是男性HCC发生发展过程中的一个关键因素,可能是HCC诊断和预测复发的一个有价值的指标.     

内镜电凝止血联合荷包缝合治疗胃Dieulafoy溃疡1例

Dieulafoy溃疡是上消化道出血的少见原因,但其严重出血可危及生命。本文报道1例男性患者因“呕血、黑便4天”入院,呕血2次,总量约1 000 ml,伴黑便,入院后行胃镜检查发现胃底小弯近贲门侧见直径约8 mm凹陷溃烂,覆白苔,中央部分可见红色血管裸露,诊断为：胃Dieulafoy溃疡。在给予钛夹夹闭胃底溃疡过程中,可见溃疡中央裸露动脉喷射性出血,遂立即给予止血钳凝闭出血血管,观察10分钟无活动性出血,后钛夹联合尼龙绳荷包缝合溃疡面,患者恢复顺利,随访3个月未再呕血、黑便。针对Dieulafoy溃疡,目前广泛采用内镜下治疗,包括硬化、套圈治疗、热凝止血、OTSC（Over the scope clip）等,本例患者采用荷包缝合获得良好效果。综合文献分析荷包缝合用于内镜下黏膜创面的闭合,成功率高,术后并发症少。     

微波辅助的蛋白质酶解方法

<正>近些年,蛋白质组学研究技术手段不断进步,研究策略不断更新,归纳起来主要分为2种策略:"top-down"策略和"bottom-up"策略。"top-down"策略是先对蛋白质混合物进行分离,然后进行蛋白质酶解和质[1-2]