抗栓肽Ala~(34)→Trp突变体的表达及活性研究

目的:将抗栓肽34位的丙氨酸突变为色氨酸,构建活性较高的突变体。方法:通过设计合成两对引物经PCR获得抗栓肽突变体基因,利用质粒pET32a( )作为载体,在大肠杆菌BL21(DE4)内表达。利用融合蛋白本身的组氨酸标签,以金属亲和色谱进行纯化,然后用肠激酶切除融合部分,所得蛋白用体外抗血小板凝集实验检测其活性。结果与结论:抗栓肽突变体以可溶形式高效表达,活性检测显示其抑制二磷酸腺苷诱导的血小板聚集的IC50为150 nmol/L。与原型蛋白相比,突变体活性明显提高。     

色谱法纯化抗体研究进展

近年来,越来越多的抗体被用于疾病的诊断与治疗,已占据生物药品市场的20%,对抗体的大量需求就要求我们对新的抗体纯化策略进行探索。在过去的几十年里,学术界和产业上的进步共同推动了抗体分离纯化技术的发展,色谱法已经成为抗体分离纯化的一个重要方法,并将继续在抗体纯化领域发挥重要作用。文章对当前的色谱法纯化抗体的技术及其应用进行了一个简要的综述。     

药物生物信息学课程教学探讨

探讨了药物生物信息学本科教学中教材的选择、教学方式的改革及如何在教学当中培养学生的实践能力和创新能力等问题。     

酵母发酵生产谷胱甘肽的培养基优化

目的应用Plackett-Burman设计和球面对称设计实验,对酵母发酵生产谷胱甘肽的培养基进行优化。方法首先通过Plackett-Burman设计方法从10个因素中选择出对发酵产量影响较大的因素,即葡萄糖、酵母膏和半胱氨酸含量,然后用球面对称设计对这3个因素各取5个水平进行优化。结果最佳培养基组成为:葡萄糖23.64g/L,酵母膏29.07g/L,半胱氨酸1g/L,(NH4)2SO42g/L,蛋白胨5g/L,KH2PO41g/L,MgSO41g/L,NaCl2g/L。在优化条件下,发酵液中谷胱甘肽积累量可达162.3mg/L,比优化前产量提高约56.2%。结论证明用Plackett-Burman设计和球面对称设计寻求菌体积累谷胱甘肽的最佳培养基组分是可行的。     

人心肌肌钙蛋白I(cTnI)基因在大肠杆菌中的融合表达和纯化

目的:研究人cTnI基因在大肠杆菌中的融合表达和纯化.方法:以pCOMb3-cTnI为模板,用PCR方法得到了编码该蛋白的基因,进一步将该基因克隆到中间载体pUCm-T,再酶切得到cTnI基因插入到pKL载体中,构建成表达质粒pKL-cTnI.在BL21细胞中经IPTG诱导表达,利用载体携带6×His纯化标签,以HisTrap Kit纯化重组蛋白,并进行免疫活性测定.结果:融合蛋白在大肠杆菌中得到高效表达,并用HisTrapKit成功纯化目的蛋白.ELISA分析证实该重组蛋白具有与天然心肌肌钙蛋白相似的免疫活性.结论:本研究为建立急性心肌梗死早期诊断试剂奠定了基础.     

高产谷胱甘肽酵母菌的诱变选育以及发酵条件的初步研究

谷胱甘肽是生物体内重要的活性3肽.对野生酵母菌进行紫外结合激光诱变筛选,得到一株Sac-charomyces cerevisiae2-2-2谷胱甘肽高产酵母菌.同时对加入前体氨基酸发酵条件进行了优化,使得谷胱甘肽产量提高了68.7%.     

金属β-内酰胺酶TMB-1三维结构模建及活性位点的分析

目的：模拟金属D-内酰胺酶TMB-1三维结构,分析其结构特点与水解活性之间的关系。方法：运用DS2．5版软件搜索模板、序列比对和构建模型,用Ramanchandran图和3DProfile程序验证模型,经分子动力学优化与水解后氨苄西林Libdock对接,再经动力学优化后与NDM-1重叠分析模型活性位点关键残基。结果：经Ra—manchandran图和3DProfile分析,表明TMB-1蛋白模建结构较为合理;重叠分析显示其空间结构为与其他金属D-内酰胺酶类似的αββα折叠,其锌配位残基具有高度的序列和结构保守性。结论：TMB-1相比NDM-1活性位点Loop3和Loopl0上氨基酸残基自由度的降低可能是造成特异水解活性重要原因之一。     

IMP型金属β-内酰胺酶活性中心的计算机模拟分析

应用信息论方法和计算机模拟的方法,对IMP型β-内酰胺酶序列及活性中心进行分析,结果表明在配体结合部位的大部分残基是高度保守的,但也有部分残基易发生变异,如32位Pro、31位Val和163位Try,这些变异是引起该酶不同变异型对β-内酰胺类抗生素水解能力不同的重要原因,在设计抑制剂时需考虑在酶高变区附近分子的柔性,以防出现新突变型而对昕设计抑制剂产生抗性.将酶和底物亚胺培南及青霉素G对接结果表明.底物与酶的结合自由能与酶的催化活性间有很好的相关性,可作为评估底物或酶抑制剂结合能力的重要评价指标.对接模型更细致地显示了酶中与底物相互作用的氨基酸残基,为酶抑制剂的合理设计奠定了基础.     

抗栓肽基因的克隆和表达

抗栓肽(Decorsin)是糖蛋白Ⅱb-Ⅲa(GPⅡb-Ⅲa)的强拮抗剂,能抑制血小板聚集。实验通过设计两对引物,经PCR获得抗栓肽的结构基因,并将基因插入原核表达载体pET32a硫氧还蛋白(TrxA)的下游。将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3),进行诱导表达,表达产物以可溶形式存在于胞内,占菌体总蛋白的35%。利用表达载体自身所带的His×6纯化标签,可将融合蛋白通过金属螯合亲和层析柱一步纯化,纯化的蛋白质经SDS-PAGE分析达到电泳纯。体外的抑制血小板聚集实验结果表明,融合蛋白具有显著的抑制ADP诱导的血小板聚集活性,抑制常数IC50为500 nmol/L。     

免疫球蛋白结合结构域的研究进展

Z结构域,又叫免疫球蛋白结合结构域,是由金黄色葡萄球菌蛋白A(Staphylococal Protein A,SPA)中B结构域改构而成。SPA是从金黄色葡萄球菌的细胞壁中发现的能与多种哺乳动物的抗体相结合的天然蛋白,组成SPA的5个结构域中,以B结构域的抗体结合力及稳定性占绝对优势。将B结构域28～29位敏感性残基Asn-Gly定向诱变成为Asn-Ala后,得到的结构域被称为Z结构域,其稳定性更高,可耐受羟铵和溴化氢的处理。首尾相连的两个Z结构域,被命名为ZZ结构域,具有与SPA相类似的抗体结合容量以及更高的稳定性,可以耐受工业纯化中苛刻的环境。ZZ结构域以其独特的反3α螺旋结构、以及特有的抗体结合能力已广泛应用于外源蛋白的可溶表达及免疫检测、抗体纯化等领域。该文将对ZZ与抗体结合的机制研究以及它在各领域的应用研究进行综述。