苦瓜核糖体失活蛋白MAP30基因的表达及特性分析

目的:克隆苦瓜MAP30蛋白基因的cDNA序列,并在体外进行原核表达和纯化,体外测定MAP30对镰刀菌的抑制作用并测定MAP30基因的表达模式.方法:利用RT-PCR技术扩增861 bp的苦瓜蛋白MAP30基因编码区序列,克隆至pMD18-T载体.构建苦瓜MAP30原核表达质粒pET-28a-MAP30,SDS-PAGE和Western blot检测MAP30的表达.采用镍离子亲合层析纯化MAP30,并采用真菌抑制实验检测对镰刀菌的抑制作用,Northern blot检测其表达模式.结果:克隆片段与基因库所登录的序列一致,表达的MAP30蛋白相对分子质量约为30 000,MAP30体外能抑制镰刀菌的生长,镰刀菌能诱导MAP30基因的表达.结论:MAP30基因可能参与植物早期的过敏反应并在植物的抗病中发挥重要的作用.     

苦瓜蛋白MAP30对大肠癌细胞株LoVo细胞生长及凋亡的影响

目的:观察苦瓜蛋白MAP30对大肠癌细胞株LoVo细胞生长及凋亡的影响.方法:采用MTT比色法分别观察20、40、60、80和100 mg/L MAP30处理48 h及40 mg/L MAP30处理24、36、48和72 h对LoVo细胞生长的影响,计算细胞生长抑制率.采用流式细胞仪检测40 mg/L MAP30处理24 h对LoVo细胞凋亡的影响.采用Northern blot和Western blot分别检测40 mg/L MAP30作用于LoVo细胞0～120 h,细胞bcl-2和bax基因和蛋白的表达.结果:MAP30可呈剂量、时间依赖性抑制LoVo细胞的生长(F=128.3,107.5,P＜0.05),促进LoVo细胞凋亡(F=92.7,P＜0.05).MAP30还可上调Bax基因与蛋白表达,下调Bel-2基因与蛋白的表达.结论:MAP30可影响LoVo细胞Bcl-2和Bax的表达,从而诱导细胞凋广,抑制细胞生长.     

氨基脲敏感胺氧化酶对弓形虫感染小鼠组织器官毒性作用研究

[目的]以真核单细胞微生物弓形虫为实验对象研究氨基脲敏感胺氧化酶(SSAO)的细胞毒性作用. [方法]通过腹腔注射和脂肪组织感染途径小鼠感染来自腹腔液传代弓形虫,6 d后,取脂肪组织制备组织切片并进行HE染色,观察脂肪组织病变及弓形虫在脂肪组织的存在情况,并采用酶联分光光度法检测小鼠脏器组织SSAO的活性.根据弓形虫P1基因设计引物,通过PCR方法检测脂肪组织、肝脏、脾脏、肺和脑各组织弓形虫的感染情况. [结果]腹腔注射组小鼠脂肪细胞病变严重,且发现有大量弓形虫存在,脂肪组织注射组小鼠非注射处脂肪组织结构基本正常,且没有检测出弓形虫感染,而其他组织器官检测到大量弓形虫感染.与其他组织器官相比较,小鼠脂肪组织中SSAO的活性最高. [结论]脂肪细胞由于表达大量SSAO其分解底物后对真核生物的细胞感染具有毒性作用,这可能与SSAO所致血管内皮细胞损伤从而引起的动脉粥样硬化的产生与发展有着内在的联系.     

黄芪提取物对小鼠生长性能、抗氧化及免疫功能的影响

目的：研究黄芪提取物对小鼠生长性能、抗氧化及免疫功能的影响。方法：60只健康小鼠随机分为A、B、C三组,每组20只。A组为生理盐水对照组,B、C组为试验组,过对小鼠连续14 d灌胃黄芪提取物,称量小鼠的体重变化,测定肝脏SOD、CAT、GSH-Px活性和MDA浓度,计算小鼠胸腺指数和脾脏指数,并测定小鼠脾淋巴细胞增殖活性。结果：与对照组相比,试验组的小鼠体重,肝脏组织中SOD、CAT、GSH-Px的含量,小鼠的脾脏指数和胸腺指数,均有显著提高（P〈0.05）;肝脏中MDA水平显著降低;MTT比色法测定脾淋巴细胞增殖能力（OD值）与对照组相比,均显著提高（P〈0.05）。结论：以活性成分黄芪多糖为主的黄芪提取物能显著增加小鼠体重和免疫器官的总质量,能明显提高机体免疫功能和抗氧化机能,并且对小鼠淋巴细胞增殖具有很强的促进作用。     

重组苦瓜MAP30蛋白对大肠癌LoVo细胞凋亡的影响

目的:克隆及重组苦瓜蛋白MAP30,观察MAP30对大肠癌LoVo细胞凋亡的影响.方法:RT-PCR法克隆MAP30基因的cDNA序列,并表达、纯化MAP30蛋白;MTT法测定纯化的MAP30蛋白对LoVo细胞的生长抑制作用;彗星实验观察MAP30引起凋亡的LoVo细胞基因组的降解情况.结果:成功克隆了苦瓜蛋白MAP30基因;MAP30蛋白对LoVo细胞体外生长具有抑制作用;MAP30蛋白对LoVo细胞半数抑制质量浓度(IC50)为70.0 mg/L.MAP30在体外能诱导LoVo细胞凋亡.结论:重组的苦瓜MAP30蛋白在体外能抑制LoVo细胞生长,并能诱导其凋亡.     

苦瓜蛋白MAP30在毕赤酵母中的表达及其诱发胃腺癌细胞MCG803凋亡的研究

[目的]克隆苦瓜蛋白MAP30基因,并在毕赤酵母中表达和纯化其融合蛋白,体外测定MAP30诱发胃腺癌细胞MCG803凋亡. [方法]利用RT-PCR技术扩增861 bp的苦瓜蛋白MAP30基因编码区序列,克隆至pMD18-T载体.构建苦瓜MAP30毕赤酵母表达质粒pPICZaA-MAP30并导入毕赤酵母Pichia pastoris GS115.SDS-PAGE和Western印迹检测MAP30的表达.采用镍离子亲合层析纯化MAP30并通过单细胞凝胶电泳和MTT实验检测其诱发胃腺癌细胞MCG803的凋亡. [结果]克隆片段与基因库所登录的序列相一致,分泌表达的MAP30-His融合蛋白分子量约为30kDa,MAP30体外能诱发胃腺癌细胞MCG803凋亡,MAP30对MCG803半数抑制浓度(IC50)为72.0 μg·ml-1,在一定浓度下,能使肿瘤细胞形成明显的凋亡细胞核;通过单细胞凝胶电泳,能看到明显的慧星尾,表明MAP30引起了肿瘤细胞基因组的降解. [结论]MAP30可作为一个抗肿瘤药而应用于临床研究.     

小鼠B16黑色素瘤细胞酪氨酸酶基因的克隆及在毕赤酵母中的表达

目的:克隆酪氨酸酶基因(TYR), 并在毕赤酵母中表达和纯化其融合蛋白, 体外测定纯化的TYR活性.方法:利用RT-PCR技术, 从小鼠B16黑色素瘤细胞中克隆全长TYR, 克隆至pMD18-T载体, 进行双链核苷酸序列测定.构建TYR毕赤酵母表达质粒pPICZaA- TYR并导入毕赤酵母Pichia pastoris GS115, 表达的重组蛋白用SDS-PAGE和Western blot进行分析, 采用Co2 离子亲和层析柱纯化TYR并采用TYR多巴速率氧化法体外测定纯化的TYR活性.结果:克隆了TYR基因.构建了重组表达质粒pPICZaA-TYR.SDS-PAGE和Western blot分析显示, 在相对分子质量(Mr)为约53 000处出现1条特异性蛋白带, 且能与兔抗TYR抗体发生反应.结论:克隆TYR基因片段与基因库所登录的序列相一致, 并在毕赤酵母中获得表达和纯化并在体外测定了纯化的TYR活性.