恶性疟原虫FCC1/HN株环子孢子蛋白的原核表达、纯化及其对肝细胞靶向作用的观察

目的从恶性疟原虫FCC1／HN株基因组中扩增得到环子孢子蛋白(circumsporozoite protein,CSP)的全长编码基因,克隆至原核表达载体pET-32c中进行表达纯化,观察重组环子孢子蛋白对肝细胞的结合能力,探讨其作为原发性肝癌基因治疗的靶向分子的可行性。方法根据恶性疟原虫3D7株环子孢子蛋白的编码序列设计一对引物,利用聚合酶链反应(PCR)技术从恶性疟原虫FCC1／HN株基因组中扩增出CSP的全长编码基因,将其克隆到载体pGEM-T中,通过基因测序加以证实;进一步亚克隆至原核表达载体pET-32c中,在大肠杆菌BL21中用IPTG诱导表达,表达产物用Ni2+螯合柱亲和纯化,采用免疫印迹技术(WB)对纯化的融合蛋白进行免疫反应性检测;采用免疫组化(IHC)技术观察重组环子孢子蛋白对不同组织细胞的结合能力。结果从恶性疟原虫FCC1／HN株基因组中成功扩增到1263 bp的全长CSP基因,该基因在原核系统中经诱导表达出一相对分子质量(Mr)约62×103大小的融合蛋白,表达产物以包涵体的形式存在;通过Ni2+亲和柱纯化获得重组CSP融合蛋白;WB表明,重组CSP融合蛋白能被疟原虫阳性血清特异性识别;免疫组化结果显示重组CSP融合蛋白能够与肝癌和正常肝细胞特异性地结合,与其他组织来源的细胞则未见反应。结论CSP是疟原虫子孢子表面主要的蛋白,重组环子孢子蛋白作为原发性肝癌基因治疗的靶向分子具有一定的潜在应用价值。     

重组结核分枝杆菌特异性分泌抗原融合蛋白的活性鉴定及初步应用

目的：融合表达结核分枝杆菌分泌蛋白CFP10-ESAT-6或ESAT-6-CFP10，研究其免疫学特性，为结核病的血清学诊断提供物质基础。方法：将一个柔性的氨基酸“接头”插入原核表达载体pET32c（＋）中，构建pET32c（＋）-linker。PCR法扩增CFP10、ESAT-6基因。将CFP10克隆入改建的载体pET32e（＋）的linker前，ESAT-6克隆入linker后，构建CFP10-ESAT-6融合基因；或将ESAT-6克隆入改建的载体pET32c（＋）的linker前，CFP10克隆入linker后，构建ESAT-6-CFP10融合基因，分别转化大肠杆菌XL1-blue，抽提质粒，酶切鉴定；在大肠杆菌B121中表达，通过Western blot分析其抗原性。结果：两个目的基因分别被按顺序成功克隆入载体pET32c（＋）的linker前或后。重组质粒pET32c（＋）-CFP10-ESAT-6或pET32c（＋）-ESAT-6-CFP10靶基因的测序结果与预计序列完全一致。融合蛋白在B121菌中高效表达。Western blot分析表明，融合蛋白与活动性肺结核患者血清能发生特异性免疫反应。结论：成功地构建了多抗原基因DNA质粒；pET32e（＋）-CFP10-ESAT-6或pET32c（＋）-ESAT-6-CFP10质粒在B121菌中能高效表达rCFP10-ESAT-6或rESAT-6-CFP10融合蛋白，该蛋白兼具CFP10和ESAT-6两种蛋白的抗原性。本研究为rCFP10-ESAT-6或rESAT-6-CFP10融合蛋白在结核病血清学诊断中应用奠定了基础。     

日本血吸虫SjC21.7核酸疫苗诱导小鼠保护性免疫作用的研究

目的　研究日本血吸虫中国大陆株 2 1.7k Da膜蛋白分子 (Sj C2 1.7)核酸疫苗对 BAL B/ c小鼠的免疫保护性作用。　方法　采用 PCR方法扩增出特异性 Sj C2 1.7基因的开放阅读框序列 ,在其起始密码子处引入 Kozark序列。将目的基因片段亚克隆到真核表达质粒 pc DNA3.1中 ,构建重组真核表达质粒 Sj C2 1.7- pc DNA3.1。 4 8只 BAL B/ c小鼠分为对照组、实验组和加强组。对照组小鼠的股四头肌注射接种 pc DNA3.1,实验组同法注射重组质粒 Sj C2 1.7- pc D-NA3.1,加强组除注射重组质粒 Sj C2 1.7- pc DNA3.1外 ,同时注射重组质粒 P35 - pc DNA3.1及 P4 0 - pc DNA。每隔 2 wk免疫 1次 ,共免疫 3次。第 3次免疫后第 30天 ,每只鼠感染 4 5± 1条尾蚴 ,4 5 d后剖杀计数各组小鼠成虫数及肝卵数。通过 EL ISA和免疫组化分析观察小鼠免疫学特征的变化。　结果　免疫组化分析显示 ,实验组小鼠股四头肌局部组织有特异性抗原蛋白表达。EL ISA分析表明 ,免疫后实验组和加强组有部分小鼠出现特异性 Ig G抗体。与对照组比较 ,实验组减虫率及减卵率分别为 2 9.9%及 13.8% ,加强组分别为 31.9%及 2 8.0 %。加强组减卵率显著高于实验组(P<0 .0 5 )。　结论　 Sj C2 1.7核酸疫苗能诱导 BAL B/ c小鼠产生一定水平的抗血吸虫感染     

刚地弓形虫RH株GRA6分子基因克隆与序列分析

目的　克隆刚地弓形虫 RH株致密颗粒抗原 (Dense granule antigen,GRA6 )分子基因 ,为研究使用重组的GRA6分子作为抗原进行弓形虫病诊断奠定基础。　方法　根据己知的 GRA6序列合成一对引物 ,抽提弓形虫速殖子m RNA,以速殖子 m RNA为模板 ,通过反转录 PCR(RT- PCR)扩增出 GRA6的 c DNA条带。目的基因 DNA条带被克隆到质粒 p UC19中形成重组质粒。对重组质粒 DNA进行纯化 ,并对目的基因片段进行核苷酸序列分析。　结果　通过RT- PCR从 m RNA中扩增出一条分子量约 70 0 bp的 DNA条带。核苷酸序列分析表明 ,GRA6分子基因的开放的阅读框全长为 6 93bp,编码 2 30个氨基酸分子 ,与已报道的 RH株 GRA6分子具有 10 0 %的同源性。　结论　本研究获得了刚地弓形虫 RH株的 GRA6分子基因 ,为今后应用此分子作为抗原诊断弓形虫病奠定了基础     

血吸虫对吡喹酮抗药性的研究Ⅱ曼氏血吸虫吡喹酮敏感株与抗性株虫卵和毛蚴对吡喹酮的反应性

目的　比较曼氏血吸虫吡喹酮敏感株与抗性株虫卵和毛蚴对吡喹酮的反应性 ,旨在运用敏感株与抗性株反应性间的差异 ,建立简单快速吡喹酮敏感性检测方法。方法　将各株虫卵分别孵育于 5× 10 -6、10 -6、5× 10 -7mol/ L和 10 -7mol/ L吡喹酮溶液中 2 4h,后移至清水孵化 ,比较虫卵的孵化率。将各株毛蚴分别暴露于 10 -3 、10 -4 、10 -5、5× 10 -6、10 -6、5× 10 -7mol/ L和 10 -7mol/ L吡喹酮溶液中 ,0、1、5 min后观察比较毛蚴的运动及形态学变化。结果　经 10 -6mol/ L 和 5× 10 -7mol/L吡喹酮孵育 2 4h后 ,敏感株血吸虫虫卵的孵化率分别为 4.2 %和 3 0 .7% ,抗性株分别为 2 4.2 %和61.2 %。当毛蚴暴露于 5× 10 -6mol/ L吡喹酮中 ,敏感株 10 0 %毛蚴体中部立刻收缩变形 ,而抗性株仅见 13 .4%毛蚴变形 ;当暴露于 10 -6mol/ L 吡喹酮 0、1、5 min后 ,敏感株毛蚴的变形率分别为3 5 .5 %、63 .9%、91.2 % ;抗性株分别为 0、7.6%、14 .3 %。结论　曼氏血吸虫吡喹酮抗性株和敏感株虫卵与毛蚴阶段对吡喹酮的体外反应性的差异均非常显著。提示 ,将毛蚴移入 10 -6mol/ L吡喹酮溶液中 1min,镜下观察其变形率 ,作为曼氏血吸虫对吡喹酮敏感性的检测方法 ,可用于现场判断病人化疗失败的原因是否是由于吡喹酮抗性     

日本血吸虫虫卵毛蚴中带信号序列基因的全长cDNA序列分析

目的 对带有信号序列的日本血吸虫虫卵毛蚴基因的全长cDNA序列进行分析。方法 根据日本血吸虫虫卵毛蚴中带信号序列的cDNA片段序列设计合成基因特异性引物。以虫卵的第一链全长cDNA为模板，采用套式PCR，快速扩增带信号序列的虫卵毛蚴cDNA的5’、3’末端片段，将特异性扩增片段进行TA克隆与序列分析。将每个带信号序列的虫卵毛蚴cDNA片段序列与其5’、3’末端片段序列进行比对和拼接，构建每个带信号序列的虫卵毛蚴基因的完整全长cDNA序列，对部分带信号序列虫卵毛蚴基因的信号序列所对应的基因组序列结构进行分析。结果 本研究分析了30个带有信号序列的cDNA片段，其中16个片段的5’、3’末端cDNA序列被成功扩增，并测定了它们的DNA序列，通过序列比对和拼接，获得了该16个虫卵毛蚴基因的全长cDNA序列。对开放阅读框演绎的氨基酸序列进行分析，发现基因SjP4001与SjP1531的信号肽序列完全相同，而基因SjP3742和SjP1183的信号肽氨基酸序列甚为相似，从而进一步证明不同的基因可拥有相同或相似的信号肽。基因组序列分析表明，基因SjP1183的信号肽基因序列与成熟肽基因序列通过交替拼接（alternative splicing）方式进行拼接；而基因SjP4001、SjP1531、SjP3742的信号肽基因序列与成熟肽基因序列之间可能是通过转移拼接的方式进行拼接。结论 确定了16个带有信号序列的虫卵毛蚴基因的全长cDNA序列，虫卵毛蚴基因可通过交替拼接方式或转移拼接方式获得信号肽序列。     

血吸虫病网络地理信息系统软件开发及应用

目的利用网络地理信息系统（WebGIS） 技术开发江苏省血吸虫病网络地理信息系统.方法在江苏省血吸虫病地理信息系统（GIS）数据库的基础上,利用ESRI公司的ArcIMS软件开发主动式江苏省血吸虫病WebGIS.结果江苏省血吸虫病WebGIS已初步开发完成,并在江苏省血吸虫病防治研究所内部局域网试运行,实现了江苏省血吸虫病管理控制中相关的各类地理数据、属性数据、专业库、资料库数据的统一管理,提供各种查询、显示、分析、统计以及图形输出等功能.结论利用WebGIS技术开发血吸虫病GIS是可行的,为建立江苏省血吸虫病管理决策系统提供了基础.     

应用重组抗原(rSAG1)检测IgM抗体诊断弓形虫病的研究

目的以刚地弓形虫RH株重组主要表面抗原1作为检测抗原,建立检测弓形虫IgM抗体的rSAG1-ELISA.方法用Ni2 螯合柱纯化重组抗原rSAGI;以不同浓度的rSAG1的包被聚苯乙烯酶标条,阳性和阴性混合血清分别作1:100和1:200稀释,以辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgM为二抗,采用正交试验确定rSAG1-ELISA的最佳检测条件;按其最佳检测条件分别对弓形虫IgM阳性和阴性混合血清重复测20次进行精确度的检测;采用抗体抑制试验检测其特异性;同时对用进口试剂盒筛得的35份弓形虫IgM阳性血清和57份弓形虫IgM阴性血清进行检测.结果 制备的rSAG1重组蛋白纯度在90%以上;rSAG1-ELISA的最佳检测条件为:rSAG1的包被浓度为2.5μg/m1,血清稀释度1:100,酶标记的羊抗人IgM 1:4 000稀释;用rSAG1-ELISA对混合弓形虫IgM阳性和阴性血清的重复检测表明:IgM阳性混合血清检测值的变异系数(CV值)为13.8%,IgM阴性混合血清的CV值为7.7%;灵敏度检测表明血清稀释度在1:50～1:200均可检出阳性;特异性试验的抑制率为62.0%;rSAG1-ELISA与进口试剂盒的总符合率为88.0%,其中阳性和阴性符合率分别为82.9%(29/35)和91.2%(52/57).结论 rSAG1-ELISA具有较好的灵敏度和特异性,与进口试剂盒相比有较高的符合率,表明该法对弓形虫病早期诊断具有较高的价值,可进一步推广应用.     

日本血吸虫SjC23蛋白质疫苗对核酸疫苗免疫增强作用的研究

目的　研究 Sj C2 3蛋白质疫苗对 Sj C2 3DNA疫苗增强小鼠的免疫保护作用的效果。方法　分别构建和制备 Sj C2 3DNA疫苗 (pc DNA3.1- Sj C2 3)和 Sj C2 3大亲水片段融合蛋白质 (GST-HD)疫苗。把 48只 BAL B/ c小鼠随机分为 A、B、C、D 4组 ,每组 12只。 A组 (DNA和蛋白质疫苗联合免疫组 )每只小鼠分别在第 0、2周经股四头肌注射 10 0μg Sj C2 3质粒 DNA,在第 4周经背部皮下多点注射 5 0 μg GST- HD+5 0 μg CFA;B组 (Sj C2 3DNA组 )每只小鼠分别在第 0、2、4周经股四头肌注射 10 0 μg Sj C2 3质粒 DNA;C组 (蛋白质疫苗组 )于第 4周每鼠经背部皮下多点注射 5 0 μgGST- HD+5 0 μg CFA1次 ;D组 (对照组 )每鼠分别在第 0、2、4周肌注 10 0 μg pc DNA3.1。各组在末次免疫后 4周每鼠以 45± 2条日本血吸虫尾蚴攻击感染 ,攻击后 45 d剖杀小鼠 ,计数成虫及肝内虫卵数。在免疫前、末次免疫后和攻击后从小鼠尾静脉采血 ,分离血清 ,用 Western- blot法检测抗体反应。结果　联合组与质粒对照组相比 ,获得了 42 .9%的减虫率和 6 0 .0 %的减卵率 ,均显著高于单独Sj C2 3DNA疫苗组 2 8.1%的减虫率和 37.9%的减卵率 ,及单独蛋白质疫苗组 (GST- HD) 2 3.8%减虫率和 39.5 %的减卵率 (P均 <0 .0 5 )。联合组抗体水平     

日本血吸虫23 kDa膜蛋白DNA疫苗和蛋白质疫苗联合应用免疫保护性作用的研究

目的　研究 Sj C2 3DNA疫苗和 Sj C2 3蛋白疫苗联合免疫对 C5 7BL/ 6感染小鼠的免疫保护作用。方法　分别构建和制备 Sj C2 3DNA疫苗 (pc DNA3.1- Sj C2 3)和蛋白疫苗 (Sj C2 3大亲水片段融合蛋白 GST- HD)。 4 8只 C5 7BL / 6小鼠随机分为 A、B、C、D 4组 ,每组 12只。 A组 (Sj C2 3DNA+GST- HD联合应用组 )每只小鼠分别在第 0、2周经股四头肌注射 10 0μg Sj C2 3质粒 DNA,在第 4周经背部皮下多点注射 5 0 μg GST- HD+5 0 μg CFA;B组 (Sj C2 3DNA组 )每只小鼠分别在第 0、2、4周经股四头肌注射 10 0 μg Sj C2 3质粒 DNA;C组 (蛋白疫苗组 )于第 4周每鼠经背部皮下多点注射5 0μg GST- HD+5 0μg CFA 1次 ;D组 (对照组 )每鼠分别在第 0、2、4周肌注 10 0μg pc DNA 3.1。各组在末次免疫后 30 d每鼠以 4 5± 2条 /只日本血吸虫尾蚴攻击感染 ,攻击后 4 5 d剖杀小鼠 ,计数成虫及肝内虫卵数。在免疫前、末次免疫后和攻击后从小鼠尾静脉采血 ,分离血清 ,用 Western- blot法检测抗体反应。结果　联合组与质粒对照组相比 ,获得了 36 .9%的减虫率和 30 .7%减卵率 ;而单独Sj C2 3DNA疫苗组的减虫率为 2 6 .9% ,显著低于联合组 (P<0 .0 5 )和 2 2 .2 %的减卵率 ,单独蛋白疫苗组 (GST- HD)为 15 .2 %和 12 .2 %