肝癌组织靶向性正义与反义表达载体pEBAF/N-ras的构建

目的用分子克隆技术构建肝癌组织特异性N-rascDNA正义与反义表达载体.方法用BamHI酶切携带目的基因的质粒pZIP-NeoSV(X)1,获得1.06kbN-rascDNA;同时以BamHI将载体pEBAF线性化,并行去磷酸化修饰,用T4DNA连接酶将两者连接,转化感受态细菌DH5α.先以酶切和随机引物法标记的N-rascDNA探针进行菌落原位杂交筛选阳性重组克隆,再以PvuⅡ酶切鉴定插入方向,同时进行DNA测序和同源性分析.结果成功构建肝癌组织特异性正义与反义表达载体pEBAF/s-N-ras和pEBAF/as-N-ras.结论成功构建的N-rascDNA正/反义表达载体,为原发性肝癌的发生机理和基因治疗研究奠定良好的基础.     

p16在肝细胞癌组织内变异的研究

应用分子杂交及免疫组化方法检测５６例ＨＣＣ组织内的抑癌基因ｐ１６。结果显示,ＨＣＣ标本中ｐ１６蛋白在癌细胞内表达的阳性率为３７５％（２１／５６）,而ｐ１６ＤＮＡ斑点杂交的阳性率为５５３６％（３１／５６）。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ转膜杂交证实,１２５％（７／５６）ＨＣＣ标本存在ｐ１６的甲基化变异,４４６４％（２５／５６）ｐ１６基因缺失。提示ＨＣＣ发生、发展过程中存在ｐ１６基因的缺失和甲基化变异     

基因工程学理论和技术教学经验浅谈

基因工程学是一门新兴的前沿科学,已成为二十一世纪生命科学中一门重要的学科,基因工程技术已渗透到医学、工业、农业等多种生命科学领域。现已利用基因工程的技术对二十多种疾病,七百多个病人进行基因治疗;已使许多疾病的发病机理得以阐明,使临床上不少疾病的诊断和治疗有了长足的进步,基因工程药物的生产和临床应用,不仅推动了医学的发展,而且带动了医药工业的腾飞;转基因植物的成功大大提高了农作物的产量并使我们的世界更加灿烂;克隆羊的出现震惊了全世界。二十一世纪,基因工程将发挥更大的作用。     

移植前血清细胞因子水平对重型再生障碍性贫血患者异基因造血干细胞移植疗效的影响研究

目的:探讨重型再生障碍性贫血(SAA)患者异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)前细胞因子IL-2、IL-6、TNF-α水平对预后的影响。方法:本研究共纳入117例SAA接受allo-HSCT的患者,回顾性分析患者总体生存率(OS)、移植物抗宿主病(GVHD)发生率、细胞因子水平与OS及主要移植并发症的关系。结果:本研究纳入的SAA患者包含同胞HLA全相合allo-HSCT 78例(66.7%),非亲缘供者allo-HSCT 12例(10.2%),单倍体相合供者alloHSCT 27例(23.1%)。所有患者5年OS率为76.0%(95%CI:64.4%-87.5%)。a GVHD累积发生率为49.6%(95%CI:40.4%-58.8%);c GVHD累积发生率为31.6%(95%CI:23.1%-40.2%)。接受同胞HLA全相合allo-HSCT的患者,其5年OS率明显优于替代供者(82.3%±6.6%vs 61.3%±11.7%)(P0.05)。HLA匹配程度、供者年龄、移植后巨细胞病毒/EB病毒(CMV/EBV)血症是影响a GVHD发生的重要因素。移植前血清IL-6增高的患者,移植后血小板植入较快(14.6±1.8 vs 18.3±2.6 d)(P=0.05);血清TNF-α增高的患者,移植后CMV/EBV血症发生率较低(37.8%±11.1%vs 58.8%±16.8%)(P=0.029)。结论:HLA匹配同胞供者allo-HSCT是SAA患者有效治疗手段;供者选择仍然是影响预后的重要因素。移植前血清IL-6和TNF-α水平增高可能预示allo-HSCT后患者血小板植入加快,CM V/EBV血症发生率减低。     

新的抑癌基因PDCD4最新研究进展

目的:程序性细胞死亡4(PDCD4)是一种新的细胞凋亡相关基因,最近来自动物和人类肿瘤的研究显示 PDCD4可能是一种新的抑癌基因,在肿瘤的发生、发展中可能发挥重要作用。本文从该基因的发现、生物学特点以及与肿瘤发生、发展的关系进行了综述。     

菟丝子丸治疗糖尿病并发症20例

糖尿病为肺、脾、肾之脏致病,其中肾为根本。肾气虚,气化不利,固摄无权,故小便频数。采用菟丝子丸补肾固摄、养心安神之法治疗,疗效明显。     

pcDNA3-HBV瞬时转染对树突状细胞的影响

目的：研究HBV感染对树突状细胞功能的影响，探讨慢性乙型肝炎患者免疫耐受发生的机制。方法：利用脂质体转染的方法，以携载HBV全基因的真核表达载体pcDNA3-HBV及对照空载体pcDNA3质粒DNA分别转染小鼠骨髓细胞，以细胞因子GM-CSF、IL-4及TNF-α诱导培养树突状细胞，RT-PCR检测转染后HBV PreS1 mRNA的表达。流式细胞术检测转染前后树突状细胞表面分子CD80的表达,3HTdR掺入法观察其刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力，流式细胞术进一步检测NF-κB RelA蛋白的表达。结果：pcDNA3-HBV瞬时转染后树突状细胞CD80表达降低，其刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力下降，NF-κB RelA蛋白表达显著减少。结论： HBV可抑制树突状细胞的分化成熟，降低其刺激T淋巴细胞增殖的功能，这可能是慢性乙型肝炎患者免疫耐受的机制之一。     

反义寡核苷酸体外抗乙型肝炎病毒研究

目的 探讨反义寡核苷酸的体外抗病毒作用,为基因水平上防治乙型肝炎病毒（HBV）感染及HBV相关肝细胞癌的基因治疗提供实验依据。方法 用PCR方法分别合成了互补于HBV X基因的翻译起始区、DR2区、ENⅡ区的反义寡核苷酸（AsON)及无关序列,其中针对ENⅡ设计的AsON,目前尚未见互补于该区段反义寡核苷酸的报道。以HBV DNA转染的HepG2．2．15细胞为靶细胞,ELISA法检测AsON作用前后细胞上清中的HBsAg和HBeAg分泌情况。结果 当AsON的最佳作用浓度为10μmol/L时,3种反义寡核苷酸对HBsAg和HBeAg抑制率分别为;57％、60％、52％和56％、45％、56％,AsON对HBV抗原的凶制作用具双峰现象。无关序列无明显抑制作用（＜12％）。利用锥虫蓝染色、四甲基偶氮唑盐比色试验观察到当AsON作用浓度为40μmol/L时,对细胞代谢无毒副作用。结论反义寡核苷酸封闭HBV X基因区的关键区段,可有效抑制HBV抗原的分泌。     

反义核酸对癌基因C-myc和N-ras蛋白表达的影响

目的为了研制新型的抗肝癌药物,观察了反义寡核苷酸对整合乙型肝炎病毒(HBV)的肝癌细胞基因治疗的作用.方法设计合成针对HBVPreS2基因翻译起始位点的反义寡核苷酸(ASON),并设非互补序列作对照,选择2.2.15细胞为细胞模型,ASON以10μmol/L浓度用药,用ELISA法观察了细胞培养上清液中HBsAg和HBeAg的变化,MTT法检测ASON对细胞的毒性作用,放射免疫方法检测细胞培养上清液中血清铁蛋白浓度.免疫细胞化学染色检测ASON对癌基因C-myc和N-ras蛋白表达的影响.结果ASON能有效地抑制HBV抗原表达,对HBsAg和HBeAg的抑制率分别为66%和91%.而ASON以20μmol/L或40μmol/L浓度用药4天对宿主细胞无毒性作用,ASON以10μmol/L浓度用药后第二天用药组和对照组血清铁蛋白浓度分别为(28.26士0.02)μg/L和(28.14土0.02)μg/L,两者相比差异无显著性(P＞0.05).用药后第3天C-myc和N-ras蛋白表达降低,和对照组相比差异有显著性(P＜0.05).结论该段反义寡核苷酸不仅抑制HBV抗原表达,而且抑制肝癌细胞的恶性表型而对宿主细胞无毒性,有可能成为有前途的抗肝细胞肝癌新药.