HCV NS5A基因在hepG2细胞中的表达以及对PI3K的影响

目的：探讨HCV—NS5A对PI3K表达的影响。方法：应用PCR技术从含有HCV全长开放阅读框的质粒中获得NS5A全长基因片段，利用基因重组技术将其克隆至真核表达载体pcDNA3．0（-）中。通过酶切、PCR及测序鉴定，NS5A基因已正确插入到pcDNA3．0（-）中，再利用脂质体转染HepG2细胞。结果：经RT—PCR及Western blot检测，HCV的NS5A基因在HepG2细胞中获得表达，而且在表达重组NS5A的转染HepG2细胞中，检测到PI3K蛋白的表达。结论：NS5A可在体外激活PI3K及其信号通路。     

以报告基因荧光素酶研究HPRE功能元件与IFN-α应答的关系

目的:以荧光素酶(luciferase,LUC)基因为报告基因,探讨HBV转录后调节序列(HPRE)的功能元件(α、β1和β2)对IFNα作用的影响。方法:用PCR法从载体pGEMluc中扩增LUC基因,并克隆入真核表达载体pcDNA3.0中。以含乙肝病毒(HBV)基因组的质粒A01为模板,扩增HPRE(完整的HPRE)、HPREαβ1及HPREβ1β2片段,并分别插入LUC基因的下游。利用脂质体介导的转染法,将重组质粒分别导入人肝癌细胞株HepG2中,用LUC检测系统检测IFNα作用前后LUC表达活性的变化。结果:经测序证实,重组质粒pcDNA3.0luc、pcDNA3.0lucHPRE、pcDNA3.0lucHPREαβ1及pcDNA3.0lucHPREβ1β2构建成功。检测结果显示,IFNα作用前,HPRE、HPREαβ1和HPREβ1β2均能提高LUC的活性,IFNα作用后,HPRE和HPREβ1β2能明显降低LUC的活性,而HPREαβ1对其表达则没有显著影响。结论:HPRE的功能元件β2与IFNα作用的关系最为密切,而功能元件α和β1在IFNα应答中作用甚小,提示IFNα诱导产生的HPRE抑制性结合蛋白很可能是与β2结合的,为进一步研究IFNα在治疗HBV感染和慢性肝炎中的作用机制,以及HPRE抑制性结合蛋白的作用提供了一定的实验依据。     

革螨、恙螨细胞培养及其特征的初步研究

目的 建立螨类细胞培养方法,为从细胞分子水平研究革螨、恙螨作为HFRS媒介提供条件。方法 采用革螨、恙螨的若虫、幼虫进行螨类细胞培养,建立螨细胞系。革螨、恙螨若虫、幼虫经消毒、胰酶消化处理后,接种于含15％FBS改良TC199培养基中培养。结果 两种螨细胞2周后细胞生长良好,并形成单层,现已传了4代。细胞形态以梭形为主,染色体2n=6,细胞对数期群体倍增时间20.50h。最能适应在TC199培养基上生长。动态观察过氨基酸要求,发现谷氨酸、酪氨酸、鸟氨酸、胱氨酸和精氨酸需量最大。结论 本结果为研究HFRSV在螨体内增殖、定位提供了条件和方法。     

不同传染性法氏囊病病毒分离株变异的研究

目的 了解不同源IBDV和不同血清亚型IBDV病毒株的变异情况。方法 用琼脂糖凝胶电泳。SDS-PAGE和序列分析等分离生物学方法分析病毒RNA、结构蛋白的变异情况。结果 (1)三种不同源IBDV均由双节段RNA组成,大小基因片段的电泳迁移率在各病毒株间无差异;(2)SDS-PAGE分析表明各IBDV的结构蛋白带谱相同,但各蛋白带的百分含量有差异;(3)序列分析表明JS3、JS4与标准对照病毒株S1 IBDV VP2基因片段的核酸的同源性均为97％,JS_3与JS_4的同源性为99％。推导编码蛋白氨基酸序列,JS_3与S_1的同源性为97％,JS4与s1的同源性为96％,JS3与JS4的同源性为98％。结论 我国流行的IBDV病毒株与标准病毒株相比不仅在免疫学反应上有差异,而且在病毒核酸序列上有变异,这种变异是造成疫苗免疫失败或免疫逃避的分子基础。     

HOXA10与连续TTAT基序结合抑制p／CAF表达

目的:转录因子HOXA10在胚胎着床和子宫内膜蜕膜化过程中发挥重要作用.p/CAF是HOXA10新的靶基因,文章旨在筛选并鉴定p/CAF启动子区与HOXA10功能性结合的序列. 方法:制备重组腺病毒HOXA10(ad-HOXA10),用于感染人子宫内膜间质细胞(hESC);构建p/CAF启动子区多种突变报告基因质粒;采用萤光素酶报告基因实验检测结合腺病毒介导的HOXA10基因过表达,分析hESC中HOXA10对p/CAF启动子转录活性的调控. 结果:获得滴度为2.4×1011ifu/mL的重组ad-HOXA10,对hESC的感染率达到80%以上.HOXA10通过结合连续的3个TTAT(-710～ -674nt)基序抑制p/CAF启动子活性,连续的3个TTAT基序的一级结构影响HOXA10的功能性结合. 结论:p/CAF启动子区连续的3个TTAT基序是HOXA10功能性结合所必须的,HOXA10可能通过调控p/CAF的表达来控制hESC的增殖与分化.     

用杆状病毒载体在家蚕细胞中表达HBeAg基因及其表达产物纯化的 …

以ＰＣＲ技术扩增含有Ｐｒｅ－Ｃ信号肽序列及完整的ＨＢｅＡｇ基因序列，克隆至家蚕核多角体病毒转移载体ｐＢｍ０３０，与野生型ＢｍＮＰＶ ＤＮＡ共转染家蚕ＢｍＮ细胞，空斑纯化后得重组病毒，研究结果表明ＢｍＮ细胞能正确识别与切割ＨＢｅＡｇ信号肽序列，所表达的ＨＢｅＡｇ效价高，纯度好，ＥＬＩＳＡ法测得培养上清中ＨＢｅＡｇ效价达１：３２０００。上清经过Ｓｅｐｈａｃｒｙ １ Ｓ－２００和ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｒｏ     

一种新免疫调节因子:B淋巴细胞刺激因子

1999年，Morre、Shu、Schneider及Mukhopadhyay等不同小组在搜索EST数据库和人嗜中性粒细胞、单核细胞cDNA文库时，先后发现了一种新的细胞因子，根据不同的功能命名如下：BEyS（B lymphocyte stimulator）、THANK（a TNF homologue that activates apoptosis，nuclear factor-κB，and c-JUN NH2-ter-minal kinase）、BAFF（B cell activating factor belonging to the TNF family）、TALL-1（TNF and apoptosis ligand-related leukocyte expressed ligand 1）以及zTNF4和TNFSF20等。     

以HBc颗粒为呈现载体的猪囊虫疫苗的构建及其免疫学研究

目的构建以HBc为载体的带有三个猪囊虫抗原表位(n1,n2,n3)的重组融合表达质粒pET-Δc-3n,表达出融合蛋白并纯化,通过免疫小鼠研究其体液免疫效果。方法用PCR法将三个猪囊虫表位分别插入HBc序列的第78-79位之间以及149位之后,再将该序列克隆入pET28a载体中,构建重组表达质粒,用大肠杆菌BL21作宿主菌表达出融合蛋白,并命名为PCCE,纯化后免疫小鼠,检测小鼠的体液免疫应答。用绦虫卵攻击免疫小鼠,并观察疫苗的保护作用。结果测序结果表明重组质粒构建成功,SDSPAGE显示融合蛋白表达正确,并有多聚体形成现象,ELISA检测到高滴度抗体。小鼠体内绦虫卵攻击试验表明疫苗PCCE的相对保护率为89%。结论以HBc为呈现载体的猪囊虫疫苗被成功表达和纯化,该疫苗能诱导较强的体液免疫反应,免疫小鼠对绦虫卵攻击具有较好的免疫保护作用。提示该疫苗PCCE可能具有预防囊虫病的潜在价值。     

用杆状病毒双穿梭载体表达系统表达HCV结构基因及HCV病毒样颗粒装配的初步观察

利用长RT-PCR技术，一次性克隆出HCV的结构基因C、E1、E2及部分5’UTR，经测序，验证了其正确性。将克隆基因插入杆状病毒双穿梭载体系统的转移载体，经转座并转染sf9细胞，得到重组病毒Bmhce，经SDS-PAGE和ELISA测定，表明HCV结构基因在重组病毒感染的SO细胞中表达；另外，电镜观察发现在重组病毒感染的SO细胞质的空泡(vesicle)中有HCV样颗粒的存在，说明HCV结构基因表达产物在SO细胞中组装出病毒样颗粒。     

汉坦病毒和恙虫病东方体复合感染的实验研究

目的了解汉坦病毒(HV)和恙虫病东方体(Ot)在宿主体内能否共生及其共生特征。方法采用HV和Ot先后交替、重复感染实验鼠,20 d后取鼠脏器切片和刮片用IFAT和Giemsa染色观察其感染率和脏器分布;并用Vero-E6细胞体外培养法研究HV、Ot在宿主细胞内的共生特征。用RT-PCR和PCR进行基因鉴定。结果HV和Ot先后交替、重复感染的各组实验鼠中,均可发现两种病原体的复合感染,其中HV和Ot单纯感染组的阳性率均显著高于HV、Ot先后和同时感染组。5组感染Vero-E6细胞培养检测结果发现:先后、同时和单纯实验感染的5组细胞中,HV和Ot先后、同时接种感染组在细胞传至第3代时检测均见有HV和Ot的双重感染,阳性率随传代次数增加而增加。而HV和Ot单纯分别感染组细胞传第2代时即可检测到HV和Ot,阳性率亦随传代次数的增加而增加。在传代培养中单纯感染组的阳性率均显著高于先后和同时感染组。用PCR和RT-PCR进行了基因鉴定得到一致的结果。结论研究结果提示HV和Ot可重复感染宿主动物,在同一宿主细胞内的感染初期有相互抑制作用,这对HV和Ot的流行病学有一定的理论意义。