应急型公共卫生人才培养模式的探索与实践

突发公共卫生问题是关系到国计民生的重大问题。围绕处置突发公共卫生事件的“侦、检、消、防、治”关键技术，加快“核、化、生”相关学科融合，改善教学支撑条件，加强教学内容改革，增设应急课程，研制便携式应急装备，形成现场快速诊断和实验室精确鉴定能力，培养学生现场处置能力和组织指挥能力，探索并实践我国高素质应急型公共卫生人才培养模式。     

肠出血性大肠杆菌O157:H7的紧密黏附素基因eae的测序及生物信息学分析

目的 克隆编码肠出血型大肠杆菌O157:H7的紧密黏附素eae基因,并对其进行测序及生物信息学分析,为研究EHEC与宿主细胞相互作用奠定基础.方法 利用PCR技术扩增eae基因,经过纯化,将其定向插入克隆载体PMD19-T simple vector并进行测序,应用生物信息学软件分析其生物学特性.结果 用PCR方法扩增eae基因,大小为2802 bp,编码934个氨基酸,用DNAstar5.0软件分析紧密黏附素(Intimin)蛋白的生物活性,在202～210、510～520、716～735个氨基酸残基的肽链上,显示该蛋白具有良好的亲水性,在175～220、300～315、550～610、710～780、825～880个氨基酸残基的肽链上具有良好的柔韧性,在220～300、615～710个氨基酸残基的肽链上,显示该蛋白具有良好的抗原性.结论 本研究用PCR法扩增出了O157:H7的eae基因,成功构建了肠出血性大肠杆菌O157:H7紧密黏附素eae基因的重组质粒,并分析了黏附素蛋白的亲水性、柔韧性、抗原性,为进一步研究大肠杆菌O157:H7黏附素的致病机制奠定了基础,为下一步表达出Intimin蛋白,进一步研究该蛋白与宿主细胞的粘附、免疫原性、抗原抗体反应提供了理论依据.     

肠出血性大肠埃希菌O157∶H7 espF基因缺陷突变株的构建及其特性初步研究

目的为研究肠出血性大肠埃希菌O157∶H7效应分子EspF功能,构建EHECO157∶H7espF基因缺陷突变株,并对其生物学特性进行初步研究。方法采用OL-PCR和自杀性质粒pCVD442介导的同源重组方法构建中间缺失162bp的espF基因缺陷突变株,并比较突变株与野生株对结肠癌细胞Lovo的黏附性。结果 PCR及序列分析证实,缺陷突变株的espF基因缺失了162bp碱基,野生株对Lovo细胞的黏附率明显高于突变株(P0.001)。结论成功构建EHECO157∶H7espF基因缺陷突变株,突变株黏附Lovo细胞能力减弱,表明EspF促进细菌的粘附,为进一步研究其在EHECO157∶H7的A/E损伤中的作用奠定基础。     

肠出血性大肠杆菌O157P:H7紧密黏附素的基因克隆、表达及功能研究

目的 获得高纯度的eae基因表达蛋白紧密黏附素(Intimin),研究其黏附作用.方法 从肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7全基因组中扩增出eae基因,T-A克隆后,将eae插入载体pET28a(+),并转化至E.coli BL21(DE3)中表达;用Ni2+-NTA琼脂糖柱纯化出重组蛋白;SDS-PAGE检测目的 蛋白相对分子质量,免疫印记分析其免疫反应性,免疫荧光检测其黏附性.结果 获得了大小约2805 bp的eae片段;构建r重组载体pET28a(+)-eae,并在E.coli BL21(DE3)中以包涵体形式表达Intimin,Mr约97 000;Ni2+-NTA琼脂糖柱纯化出Intimin;大肠杆菌O157:H7多抗血清在Mr约97 000处检测出一条特异性Intimin带;Intimin可黏附在HEp-2细胞表面.结论 高纯度的重组蛋白Intimin具有一定的免疫反应性,能与HEp-2细胞黏附,为进一步研究Intimin蛋白与宿主受体蛋白的相互作用奠定基础.     

鼠疫耶尔森菌TaqMan探针实时荧光定量PCR快速检测

目的 建立一种快速检测鼠疫耶尔森菌的方法.方法 以编码F1抗原的基因caf1为靶序列,人工合成基因序列,制备重组质粒作为鼠疫耶尔森菌检测的标准样品;用实时荧光定量聚合酶链反应(fluorescent quantitative polymerase chain reaction,FQ-PCR)技术,针对pMT1质粒上的caf1基因设计引物和TaqMan荧光探针,进行实时FQ-PCR检验,评价该方法的准确性、敏感性及特异性.建立鼠疫耶尔森菌TaqMan探针实时FQ-PCR检测方法.结果 本研究成功构建了质粒pUC57-caf1,引物、探针特异性良好,标准曲线在5.03×102～5.03×107拷贝数之间,具有较好的线性关系,相关系数1.0.实时FQ-PCR检验最低可检测出5.03×102拷贝数的重组质粒,灵敏度比普通PCR高100倍.特异性检测试验可选择性检测出鼠疫耶尔森菌,与其他细菌无交叉反应,结果与普通PCR一致.对同一浓度的重组质粒进行15个平行样品的重复性试验,Ct值标准差为0.28.结论 建立TaqMan探针实时FQ-PCR检测技术,能够快速、准确、特异的检测鼠疫耶尔森菌,为鼠疫监控、诊断提供技术支持.     

登革1型病毒荧光定量PCR快速检测

目的建立登革1型病毒的快速特异的荧光定量PCR检测方法。方法设计登革1型病毒特异的引物和TaqMan探针,制作标准曲线,并检测其特异性、重复性、再现性和敏感性,采用荧光定量PCR和常规PCR对临床标本进行检测比较。结果成功构建了标准曲线,回归方程为Y=-3.410logX+45.10,相关系数R2=0.999,扩增效率Eff=96.5%,灵敏度可达103 copies/mL,此荧光定量PCR方法对登革1型病毒检测高度特异,与其他3型登革病毒和乙型脑炎病毒之间并无交叉反应;采用登革病毒种特异引物探针和本研究建立的登革1型病毒型特异引物探针对166份cDNA样本进行荧光定量PCR检测,均发现126份为阳性,阳性率均为75.9%,Ct值为20.84～36.36,浓度范围为1～1.3×104copy/μL;常规PCR方法检测到其中36份为阳性,阳性率为21.7%。结论荧光定量PCR方法能够快速灵敏地检测登革1型病毒,并能实现对病毒滴度的绝对定量。     

中暑专题学习网站协作式学习的设计与开发

运用情境认知与学习理论设计开发《中暑》专题学习网站的协作式学习模块,探讨了在这一理论指导下,讨论区及实时交流区等的设计思路,为学生提供良好的远程互动协作平台。     

登革病毒IgG抗体的检测:基于登革病毒E蛋白的荧光素酶免疫吸附法

目的 建立基于登革病毒E蛋白特异性抗原的荧光素酶免疫吸附法（DENV-LISA）,用于检测DENV IgG抗体。方法 分别构建DENV1-E1、DENV2-E2与荧光素酶的融合表达质粒,转染293T细胞后获得含特异性抗原与荧光素酶的融合蛋白,建立DENV-LISA,评价其特异度和灵敏度,并与商用登革病毒IgG抗体检测试剂盒比较。结果 DENV-LISA阳性检出率32.4%,特异度96.6%,商用检测试剂盒阳性检出率35.3%,差异无统计学意义（P>0.05）;阳性样本稀释6400倍可判断阳性,灵敏度高;同批板间、板内检测值差异无统计学意义（P>0.05）;重复性良好。结论 建立基于登革病毒E蛋白的荧光素酶免疫吸附法,对登革病毒IgG抗体有较高特异度和灵敏度,可用于登革病毒感染的早期筛查、监测预警、流行病学调查等。     

广东地区TTV感染情况及基因分型

目的 调查广东地区ＴＴ病毒（ＴＴＶ）感染流行情况和基因分型。方法 选取ＴＴＶＯＲＦ１的保守序列作内外引物,Ⅰ型、Ⅱ型同源性极高的序列ｎｔ２４６４～ｎｔ２５２０作包被探针,异源性大于５０％的序列ｎｔ２１２５～ｎｔ２１５９作显色探针Ⅰ和显色探针Ⅱ,采用微板核酸杂交－ＥＬＩＳＡ技术对２８０例肝功能损害的肝炎患者血清进行ＴＴＶ检测及ＴＴＶ基因分型研究。结果 检测出４４例ＴＴＶ阳性患者,检出率为１５．７１％     

应急型食品微生物学综合性实验教学改革探索

[目的]开展应急型食品微生物学综合性实验教学改革,探索我国应急型公共卫生人才培养模式的建立。[方法]选择预防医学食品安全专业2006级本科生为教学对象,设计食源性致病菌检测综合性实验,参考国家及省级疾病预防控制中心(CDC)应对突发公共卫生事件微生物检验程序,实施教学改革,加强食源性疾病的调查与控制内容的学习,由学生自行设计、动手操作、分析讨论、提交检验报告。[结果]通过教学改革,帮助学生巩固实验原理,掌握专业技能,增强生物安全意识,学生面对突发卫生事件时的现场指挥处置、微生物快速检测、事件分析报告等应急能力得到加强。[结论]本教学改革对于激发学生的创新能力,提高学生应急能力和实际工作能力具有重要意义。