MEBO治疗抗癌药物致皮肤坏死的体会

许多抗癌药物如氮芥、丝裂霉素、长春新碱、阿霉素等静脉注射时，如漏于皮下，可致局部皮肤肿胀及坏死，一旦发生坏死，临床较难治愈。笔者应用MEBO治愈5例抗癌药物致皮肤坏死患者，效果满意。MEBO治疗抗癌药物致皮肤坏死的体会@王敬华$山东省齐河县人民医院!251100@郭希民$山东省齐河县人民医院!251100@左文述$山东省肿瘤防治研究院     

鼠牙乳头细胞核心结合因子cDNA片段的克隆与序列测定

目的 从培养大鼠牙头细胞中克隆核心结合因子（cbfal）的cDNA片段。方法 原代培养大鼠牙乳头细胞,提取培养细胞的总RNA,逆转录合成cDNA,用PCR的方法扩增cbfal基因片段。将获得的预期大小的PCR产物插入pUC18克隆载体中,转化TOP10感受态细胞,蓝白筛选白色克隆,进行体外扩增,提取质粒进行酶切鉴定,含目的插段的克隆在PE317-A自动测序仪上进行序列测定。结果 从培养的鼠牙乳头细胞提取的总RNA中成功克隆出691bp cbfal基因片段,测序结果和GenBank报道序列完全一致。结论 从鼠牙乳头细胞中成功克隆到cbfal基因片段,确切的证实了核心结合因子（cbfal）基因在鼠牙乳头细胞中的表达。     

软骨细胞在微载体中的培养和快速扩增

目的：探索在短期内获得大量成活率高、分化良好的兔关节软骨细胞的方法,方法：应用胰蛋白酶、胶酶消化的方法从新生新西兰兔关节软骨处分离、培养软骨细胞,并将获得的软骨细胞在旋转生物反应应（RCCS）内应用Cytodex-3微载体进行培养。应用倒置显微镜和扫描电镜对微载体表面的软骨细胞进行动态观察,并对收获的软骨细胞进行Ⅰ、Ⅱ型胶原的细胞免疫化学染色分析。结果：并节软骨细胞可快速贴附于Cytodex-3微载体表面,细胞伸展后生长加速,到培养后期,细胞密度可达最初接种的20倍。在微载体上收获的软骨细胞Ⅰ型胶原的免疫细胞化学染色呈阴性,Ⅱ型胶原染色则呈强阳性。结论：微载体细胞培养技术是一种简便、快速的体外细胞扩增方法,可为构体建组织工程化人工软骨提供大量软骨软件。     

大鼠牙胚发育早期核心结合因子1表达的时空特异性

目的:探讨采用成骨细胞特异性转录因子核心结合因子1cDNA探针对大鼠不同时期牙胚进行原位杂交实验,以及其在牙胚发育过程中的表达。方法:实验于2003-05/08在北京军事医学科学院组织工程研究中心实验室完成。取SD孕期大鼠12只,利用核心结合因子1cDNA克隆产物,自行制备核心结合因子1cDNA探针,并对同笼后11d(蕾状期)、14d(帽状期)、17d(钟状早期)及出生后1d和9d(钟状晚期)4个时期的大鼠牙胚进行原位杂交实验,观察核心结合因子1在大鼠牙胚不同时期中的表达。结果:①大鼠牙胚蕾状期原位杂交可见明显阳性表达结果,其表达部位主要集中于牙胚及牙蕾顶部邻近的外胚间充质。②帽状期及钟状早期牙乳头、成牙本质细胞及成釉细胞均呈阳性表达。③钟状晚期表现于成牙本质细胞的表达明显下调,而成釉细胞呈阳性表达。结论:核心结合因子1在牙胚不同时期的表达有时空特异性,在大鼠牙胚发育早期即蕾状期的强阳性表达,表明核心结合因子1参与了牙胚的早期发育。     

骨髓间质干细胞复合多孔磷酸钙陶瓷修复兔颅骨缺损的研究

目的探讨以骨髓间质干细胞(MSCs)作为种子细胞、β-磷酸三钙(β-TCP)多孔生物陶瓷作为支架材料构建组织工程化人工骨，修复兔实验性颅骨标准缺损的可行性。方法选择5月龄新西兰大白兔34只，制作颅骨标准缺损后分成3组。A组(n=20)：分离培养兔同胎异体MSCs。体外扩增后接种到预制的β-TCP多孔生物陶瓷材料上，细胞-材料复合体经体外孵育后，无菌条件下植入颅骨缺损；B组(n=10)：采用单纯β-TCP材料修复兔颅骨缺损；C组(n=4)：兔实验性颅骨标准缺损区未做骨修复。术后6周和12周分别处死动物、取材，进行缺损区大体、组织学、组织化学和免疫组织化学分析。结果颅骨缺损处A组术后6周表面肉眼可见骨样组织形成，组织学提示材料部分降解，未降解吸收的材料孔洞内广泛分布着新生骨组织，成骨细胞外基质丰富，I型胶原染色阳性；术后12周，支架材料几乎完全降解，缺损区被新生骨组织所取代。B组术后6周，可见从缺损区边缘有新生骨组织向支架材料内长入，支架材料部分吸收；术后12周，可见从缺损区边缘长入到支架材料内的新生骨组织逐渐增多，但材料的中心部位未发现新生骨形成。C组术后12周，仅见少量骨组织从缺损区边缘向缺损区内长入，缺损中央大部分区域未得到修复。结论体外培养扩增的兔MSCs在不添加外源性生长因子的情况下，与pTCP复合植入后可以在体内诱导、分化为成骨细胞，并能够对标准的颅骨缺损进行有效的修复，可进一步推广应用。     

永生化软骨细胞体内软骨形成的实验研究

目的　探讨以永生化软骨细胞作为种子细胞构建和形成软骨的可能性。方法　把人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)导入兔髁状突软骨细胞 ,G418筛选 ,挑选阳性克隆扩增培养 ;实验组将扩增培养的转染细胞与细胞支架材料 β 磷酸三钙 ( β TCP)复合 ,对照组将正常软骨细胞与 β TCP复合或单纯 β TCP在体外培育后种植于裸鼠皮下 ,3和 6个月取材进行组织学和免疫化学检测 ,并与对照 1组和对照 2组进行比较。结果　实验组和对照 1组可见复合体包裹软骨样组织 ,对照 2组有少量纤维样组织形成。免疫组化染色显示 ,实验组番红“O”、甲苯胺蓝和Ⅱ型胶原染色呈强阳性 ,有明显软骨组织形成 ,与对照组有显著性差异 (P <0 0 1) ,对照 1组染色呈弱阳性 ,对照 2组则为阴性。结论　永生化软骨细胞可以作为软骨组织工程的种子细胞 ,具有较好的软骨形成能力     

In Vitro Chondrogenic Phenotype Differentiation of Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells

In order to study the chondrogenic phenotype differentiation of adult sheep bone marrowderived mesenchymal stem cells (MSCs) in a defined medium as potential seed cells for cartilage tissue engineering, MSCs were isolated by density centrifugation with Percoll solution from bone marrow aspirated from sheep iliac crest. The third passage of MSCS were induced with H-DMEM containing TGF-β3 .IGF-I, Dexamethasone and VitC. The shape and ultrastructure of cells were observed, toluidine blue stain for GAG and immunohistochemistry for type II collagen were applied for chondrogenic phenotype identification. After 14 days of induction, MSCs changed from a spindlelike appearance to a polynal shape, a large amount of endoplasmic reticulum, Golgi complex and mitochondria were observed, and the differentiation of MSCs chondrogenic phenotype was verified by positive staining of toluidine blue and immunohistochemistry. MSCs derived from bone marrow can differentiate to chondrogenic phenotype when induced in vitro and can be used as optimal seed cells for cartilage tissue engineering.     

以同种异体BMMSCs为基础构建组织工程骨修复种植区骨缺损的实验研究

目的：评价以同种异体骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs）为基础构建组织工程骨修复种植体周围骨缺损的成骨效果。方法：拔除4只Beagle犬双侧下颌前磨牙,3个月后,在每侧拔牙区各植入2颗种植体,并在每个种植体远中制备骨缺损。2只犬植入同种异体BMMSCs组织工程骨（n=8,实验组）,另2只犬植入自体BMMSCs组织工程骨（n=8,对照组）。分别于移植后1、3个月取材,行大体及组织学观察,影像学方法检测种植区骨密度。结果：同种异体BMMSCs组和自体BMMSCs组术后即刻植骨区骨密度值分别为81±9和79±9,（P>0．05）,术后1个月为97±9和97±9,（P>0．05）,术后3个月为115±12和112±11,（P>0．05）。结论：以同种异体BMMSCs为基础的组织工程骨能在种植体周围较好地成骨。     

小鼠骨髓间充质干细胞分离培养新方法

本研究旨在建立一种方便、快捷、有效体外分离培养小鼠骨髓间充质干细胞（mesenchymalstemcells,MSC）的方法。在无菌条件下取小鼠股骨、胫骨,分别用全骨髓贴壁法、骨片消化法、骨髓加骨片法分离小鼠MSC,比较Msc集落出现时间、大小及数量;应用流式细胞术检测细胞免疫表型,并进行MSC成骨、成脂分化鉴定。结果表明,骨髓加骨片法出现的集落时间最早,集落数量最多,第4天集落数为20±4个;骨片消化法为11．5±2．5个;全骨髓贴壁法最少,为9．5±1．5个;到第3代时,骨髓加骨片法获得细胞数量最多,是全骨髓贴壁法和骨片消化法的2倍;流式细胞术检测结果显示,获得的细胞高表达干细胞标志之一Sca-1,高表达CDdd、CD29,不表达白细胞表面抗原CIM5和内皮细胞标志CD31等;所分离的MSC在成骨诱导体系和成脂诱导体系中能分别向成骨细胞和脂肪细胞分化,具有典型的MSC特性。结论：骨髓加骨片法是一种方便、快捷、有效的小鼠骨髓MSC分离方法。