人HMGB1基因原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达和纯化

目的  构建人高迁移率族蛋白B1（HMGB1）基因的原核表达载体,观察表达水平并纯化重组蛋白。方法  根据GenBank中人HMGB1基因序列,用OptimumGeneTM行密码子优化并合成目的基因,经PCR扩增,NdeⅠ和XhoⅠ双酶切,插入原核表达载体pQE-T7-2的相应位点,构建原核表达质粒pQE-T7-2/HMGB1。经菌落PCR、酶谱分析及序列分析鉴定重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白表达,采用SDS-PAGE和Western blot印迹法鉴定重组蛋白,Ni NTA树脂亲和纯化目的蛋白。结果  成功构建人HMGB1克隆载体和表达载体;表达的目的蛋白约占菌体总蛋白的20%以上,Western blot法显示,重组蛋白能与抗HMGB1抗体和抗His抗体特异结合,亲和层析纯化后纯度达90%以上。结论  成功构建高效稳定的重组人HMGB1原核表达载体,获得纯化人HMGB1蛋白,为进一步研究HMGB1的功能奠定基础。     

抗甲状腺治疗对Graves病患者外周血T、B淋巴细胞亚群及部分协同刺激分子表达的影响

为了研究抗甲状腺药物对Graves病患者外周血T、B淋巴细胞亚群及协同刺激分子的表达影响,探讨其在Graves病免疫病理机制中的作用,运用流式细胞术测定20例初发Graves病患者、11例硫脲类药物治疗的患者及16例正常对照外周血淋巴细胞CD19、CD40、HLA-DR、CD80、CD3、CD4、CD8、CD28等表面分子的表达水平。发现Graves病患者CD19+、CD19+CD40+、CD19+HLA-DR+、CD80+细胞比率高于正常对照组;CD3+CD8+细胞比率低于正常对照组,CD3+CD4+/CD3+CD8+比值升高,CD3+HLA-DR+细胞比率高于正常对照组。硫脲类药物他巴唑或丙基硫氧嘧啶治疗2~4月后缓解患者CD80+细胞恢复正常。与正常对照比较治疗缓解后患者CD3+CD8+、CD8+CD28+细胞比率降低,CD3+HLA-DR+、CD4+HLA-DR+升高,CD3+CD4+/CD3+CD8+比值升高。上述结果提示Graves病患者体液免疫处于较高水平,外周血活化T细胞升高,硫脲类药物可以调节部分免疫指标,其改变同临床症状的改善并非同步。     

食管癌切除术患者围手术期外周血淋巴细胞亚群的变化

采用流式细胞仪对20例食管癌患者术前、术毕及术后1d三个时间点的外周血CD4、CD8、CD3、CD19、自然杀伤细胞（NK）及CD28、CD80细胞进行检测。结果显示。术毕外周血CD3^＋、CD^＋、CD28^＋、CD28^＋CD4^＋、CD28^＋CD8^＋、CD19^＋细胞比率降低，CD4^＋／CD8^＋降低，NK细胞比率升高，术后1dCD3^＋细胞依然低于术前，CD4^＋、CD28^＋、CD28^＋CD4^＋细胞升高但尚未完全恢复至术前水平，CD8^＋细胞低于术前。CD28^＋＋CD8^＋细胞及CD4^＋／CD8^＋恢复至术前水平，CD19^＋细胞比率升高且高于术前，NK细胞恢复至术前水平。认为食管癌患者围手术期特异性免疫受抑制，而非特异性免疫处于相对优势；术后1d患者的免疫状态尚未完全恢复至术前水平。     

大鼠脑缺血半暗带区外周型苯二氮卓受体的变化及黄芪甲苷的影响

目的观察大鼠脑缺血/再灌注损伤后半暗带区外周型苯二氮卓受体(peripheral-type benzodiazepine receptors,PBRs)的变化,研究不同剂量黄芪甲苷(astragalosideⅣ,AST)对PBRs的影响。方法将60只大鼠随机分为假手术组、模型组、AST 10、40和100 mg.kg-1组5组。采用线栓法制作大鼠大脑中动脉缺血模型,于缺血2 h后再灌注24 h。采用Bederson方法进行神经功能评分,采用梯度离心法提取缺血半暗带区线粒体,应用放射配基结合实验检测线粒体[3H]PK11195特异性结合活性,测定PBRs最大结合容量(Bmax)和平衡解离常数(Kd)。结果线粒体PK11195特异性结合活性与动物神经功能缺损评分具有明显相关性(r=0.833,P<0.01)。与模型组相比,AST 10(P<0.05)、40(P<0.01)、100(P<0.01)mg.kg-1组动物神经功能障碍评分均明显减少,AST 40 mg.kg-1组与AST 100 mg.kg-1组相比,差异无显著性(P>0.05)。与模型组相比,AST 10(P<0.05)、40(P<0.01)、100(P<0.01)mg.kg-1组半暗带区Bmax明显减少。与AST 10 mg.kg-1组相比,AST 40(P<0.05)、100(P<0.01)mg.kg-1组Bmax明显减少(P<0.01)。AST 40 mg.kg-1组和100 mg.kg-1组相比,Bmax及动物神经功能缺损评分差异均无显著性(P>0.05)。各组Kd值差异无显著性(P>0.05)。结论 AST可通过降低脑缺血/再灌注后PBRs表达起到脑保护作用。     

2010年莱芜市钢城区餐饮单位食(饮)具消毒状况调查

[目的]了解莱芜市钢城区餐饮单位食(饮)具消毒状况,保障群众饮食安全。[方法]2010年6～8月对钢城区辖区内直管的250家餐饮单位(大型23家,中型65家,小型162家),依据《食(饮)具消毒卫生标准》进行餐饮具消毒效果检测。[结果]共检测样品1 805份,合格1 330份。大型餐饮单位样品检测合格率为86.67%,中型餐饮单位样品检测合格率为77.85%,小型餐饮单位样品检测合格率为63.46%(P<0.01)。小勺、茶杯、碗的消毒质量较差。[结论]卫生监督部门应加强食品从业人员知识培训,加大管理力度,确保饮食卫生安全。     

AMPK活化对INS-1细胞胰岛素释放的影响

目的研究AMPK活化对INS-1细胞胰岛素释放的作用及其可能机制。方法体外培养INS-1细胞株,观察不同浓度(0.2,0.5和1.0mmol·L-1)AICAR(AMPK激动剂)作用不同时相点(8,12和24h)对细胞内胰岛素含量及高糖刺激的胰岛素释放的影响;AICAR(0.5mmol·L-1)与Compound C(10μmol·L-1,AMPK阻断剂)单独或共同作用INS-1细胞8h,采用两种PCR(RT-PCR和实时定量PCR)方法检测PPARα基因转录水平的变化,免疫沉淀检测PPARα蛋白表达。结果与正常对照组比较,AICAR(0.2,0.5和1mmol·L-1)作用8,12和24h,均抑制INS-1细胞高糖刺激的胰岛素释放及细胞内胰岛素含量。同时,AICAR诱发的AMPK活化能增强PPARα mRNA和蛋白水平的表达。结论AICAR诱导的AMPK活化可能通过调节PPARα表达抑制INS-1细胞高糖刺激的胰岛素释放。     

中西医结合治疗对Graves病患者外周血T、B淋巴细胞亚群的影响

目的：研究中西医结合治疗对Graves病患者外周血T、B淋巴细胞亚群及部分协同刺激分子表达的影响。方法：运用流式细胞术测定20例Graves病初发患者、11例他巴唑治疗患者（西药组）、16例他巴唑合用中药五岳抗甲丸治疗患者（中西医结合组）及16例正常对照外周血淋巴细胞CD19、CD40、CD80、CD3、CD4、CD8、CD28等分子的表达水平。结果：Graves病初发患者CD19⁺、CD40⁺、CD19⁺ CD40⁺、CD80⁺细胞比率高于正常对照组(P＜0.01或P＜0.05)，CD3⁺CD8⁺细胞比率降低(P＜0.05)，CD3⁺CD4⁺/CD3⁺CD8⁺比值高于正常对照(P＜0.05)；西药组患者CD80+细胞恢复正常，CD3⁺CD4⁺细胞比率及CD3⁺CD4⁺/CD3⁺CD8⁺比值高于正常对照(P＜0.05，P＜0.01)，而CD3⁺CD8⁺及CD8⁺CD28⁺细胞比率低于正常对照(P＜0.01，P＜0.05)；除CD80+细胞比率高于正常对照外，中西医结合组所测各种分子的表达同正常对照组比较，差异无统计学意义；同西药组比较，中西医结合组CD3⁺CD4⁺细胞降低(P＜0.01)，CD3⁺CD8⁺及CD8⁺CD28⁺细胞比率升高(P＜0.01，P＜0.05)， CD3⁺CD4⁺/CD3⁺CD8⁺比值降至正常水平(P＜0.01)。结论：Graves病患者体液免疫处于较高水平，存在细胞免疫调节失衡，中西医结合治疗较单纯西药治疗更有利于患者免疫状态的恢复。     

促甲状腺激素通过抗炎蛋白CTRP3促进软骨细胞分化

目的 探讨促甲状腺激素(TSH)对软骨细胞(PMCs)分化的作用及相关机制。 方法 利用qRT-PCR、Western blotting、免疫荧光检测PMCs细胞外基质Ⅱ型胶原(Col Ⅱ)、Ⅹ型胶原(Col Ⅹ)以及基质金属蛋白酶3和13(MMP3,MMP13)的表达变化。采用qRT-PCR、ELISA检测TSH刺激PMCs后炎症因子白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNFα)的表达水平。应用高通量RNA-seq技术筛选TSH调控PMCs分化的差异表达基因,通过在原代PMCs中过表达CTRP3,探索TSH调控PMCs分化的机制。 结果 qRT-PCR、Western blotting结果显示,TSH刺激下PMCs中MMP3(P=0.016,P<0.001)和MMP13(P均<0.001)的表达显著增加。qRT-PCR、ELISA结果显示,IL-1β(P=0.007,P=0.002)、IL-6(P均<0.001)、TNFα(P=0.006,P<0.001)的表达上调。通过RNA-seq筛选出差异表达基因CTRP3。CTRP3过表达后PMCs中Col Ⅱ表达增高(F=76.062,F=77.085,F=190.115)、Col Ⅹ表达降低(F=33.494,F=38.424,F=43.351);同时与单纯TSH刺激相比,MMP3(F=88.607,F=214.145,F=135.60)、MMP13(F=116.561,F=138.674,F=86.865)表达均显著降低(P均<0.001),IL-1β、IL-6、TNFα的表达则均降低(P均<0.001)。 结论 CTRP3对TSH诱导的PMCs分化具有保护作用,有望成为亚临床甲状腺功能减退症(SCH)患者关节损伤的潜在治疗靶点。