利什曼原虫感染树突状细胞早期基因表达差异分析及关键基因筛选

目的:分析利什曼原虫感染树突状细胞(DCs)早期的基因表达与信号通路变化,探究DCs感染后应答,寻找利什曼原虫感染后基于DCs的免疫治疗方法。方法:GEO数据库下载利什曼原虫感染前后DCs基因芯片数据,RStudio软件筛选差异表达基因(DEGs),STRING构建DEGs蛋白质相互作用网络(PPI),Cytoscape筛选差异表达蛋白质的核心模块,RStudio软件对DEGs进行GO和KEGG富集分析。结果:共筛选出DEGs 129个,其中IL12B与CXCL10差异最为显著,GO分析共富集23个过程,主要涉及病毒感染过程相关细胞反应及Ⅰ-IFN相关免疫反应;KEGG分析共富集3条信号通路,分别为甲型流感、麻疹及DNA复制信号通路。结论:利什曼原虫感染DCs前后Ⅰ-IFN信号通路和TLR4/NF-κB信号通路激活,影响IL12表达,提示Ⅰ-IFN/IL12信号通路与TLR4/NF-κB/IL12信号通路可作为利什曼原虫感染治疗的靶点,CXCL10也有望成为潜在的治疗靶点;利什曼原虫感染后,出现类似病毒感染现象,推测抗病毒免疫疗法可能在对抗利什曼原虫感染中具有一定疗效。     

抗SARS-CoV-2 N蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

目的 制备针对严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)核衣壳蛋白(N)的单克隆抗体(mAbs)并鉴定其生物学特性。方法 利用大肠杆菌原核表达重组SARS-CoV-2 N蛋白,通过杂交瘤技术将小鼠骨髓瘤细胞SP2/0与经重组蛋白免疫的BALB/c小鼠的脾细胞进行融合,采用间接ELISA法和有限稀释法筛选出阳性杂交瘤细胞株,并鉴定其亚型,腹水法制备mAbs, Protein G亲和柱纯化后通过SDS-PAGE、间接ELISA和Western blot检测其纯度、效价及特异性。结果 获得5株能稳定分泌抗SARS-CoV-2 N蛋白mAbs的杂交瘤细胞株,分别命名为N1～5。通过腹水法制备获得5个mAbs,亚型鉴定结果显示1个为IgG2a*κ型、4个为IgG1*κ型,其效价均达到2×104以上。Western blot结果表明5个mAbs都能与重组SARS-CoV-2 N蛋白结合。结论通过杂交瘤技术成功制备了5个能特异性识别重组SARS-CoV-2 N蛋白的mAbs,为开发免疫诊断试剂奠定了基础。     

ω-3多不饱和脂肪酸对树突状细胞生物物理学特性及迁移能力的影响

目的 从生物物理学与免疫学交叉角度,分析二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid, EPA）、二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid, DHA）对鼠源树突状细胞（dendritic cells, DCs）生物物理学特性、细胞骨架及迁移能力的影响,探讨ω-3多不饱和脂肪酸（ω-3 polyunsaturated fatty acids, ω-3 PUFAs）对DCs免疫功能的影响及其潜在作用机制。方法 分离C57BL/6J小鼠骨髓来源单核细胞,经20 ng/mL重组鼠集落刺激因子（recombinant mouse granulocyte macrophage colony stimulating factor, rmGM-CSF）和10 ng/mL重组鼠白介素-4（recombinant mouse interleukin-4, rmIL-4）诱导分化为未成熟树突状细胞（immature dendritic cells, imDCs）,第6天加入100 ng/mL脂多糖诱导为成熟树突状细胞（mature dendritic cells, mDCs）,进一步对imDCs及mDCs进行形态学观察及CD11c阳性率分析;通过细胞增殖检测试剂盒（cell counting kit-8, CCK-8）及流式细胞仪检测不同浓度EPA和DHA（浓度均为0~60 μmol/L）作用下DCs细胞活力及凋亡情况;在确定最佳作用浓度后分别通过荧光偏振法、细胞电泳法及浓度梯度法检测分析DCs的膜流动性、电泳迁移率（electrophoretic mobility, EPM）及渗透脆性变化,并用免疫荧光法检测其细胞骨架纤维状肌动蛋白（filamentous actin, F-actin）表达,最后利用Transwell系统检测DCs迁移能力。结果 imDCs及mDCs的CD11c阳性率均在80%左右;不同浓度EPA和DHA均呈剂量依赖性降低DCs细胞活力,但并没有诱导其凋亡。在50 μmol/LEPA和DHA作用下,DCs生物物理学特性均发生改变,其中渗透脆性和EPM明显下降,膜流动性明显增大。DCs细胞骨架F-actin含量表达均明显上升,迁移率显著下降。结论 ω-3 PUFAs可能会通过改变DCs细胞骨架结构及生物物理学特性,抑制细胞迁移能力,进而影响其免疫功能。     

护网明目汤对糖尿病视网膜病变患者血流动力学及血清ICAM-1、ET-1变化的临床观察

目的探讨护网明目汤联合羟苯磺酸钙对糖尿病视网膜病变(DR)患者局部血流动力学,血清炎症因子及血管内皮因子的改善作用。方法选取80例DR患者,按随机数字表法将其随机分为治疗组和对照组各40例,80只眼。对照组患者口服羟苯磺酸钙胶囊,每次1粒,1日3次。治疗组患者在此基础上服用护网明目汤(石斛15 g、赤芍12 g、葛根12 g、天花粉12 g、楮实子12 g、丹参12 g、决明子15 g、黄精12 g)水煎剂,1日1剂,早晚分服。10 d为1个疗程,共治疗3个疗程。观察2组患者治疗前后局部血流动力学,血清炎症因子及血管内皮因子的变化。结果 2组患者视网膜中央动脉(CRA)、睫状后动脉(PCA)、眼动脉(OA)中收缩期最大流速(PSV)、舒张末期血流速度(EDV)在治疗后均较治疗前升高,血管阻力指数(RI)均较治疗前降低,差异具有统计学意义(P0.01);治疗后2组患者组间对比,治疗组患者CRA、PCA、OA中PSV、EDV均较对照组高,差异有统计学意义(P0.01),且治疗组,RI降低也更显著(P0.01)。2组患者治疗后肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、白细胞介素-6(IL-6)均较治疗前降低,差异具有统计学意义(P0.01);治疗组与对照组组间相比,治疗组降低更为显著(P0.01)。2组患者治疗后血管内皮生长因子(VEGF)、内皮素-1(ET-1)均较治疗前降低,差异具有统计学意义(P0.01);且治疗后2组患者组间相比,治疗组降低更加显著(P0.01)。结论护网明目汤联合羟苯磺酸钙可通过改变血流动力,降低血清炎症因子及血管内皮因子来治疗DR,疗效明确,有较好临床应用前景。     

转化生长因子-β1对人成熟树突状细胞生物物理特性和迁移能力的影响

目的:研究转化生长因子β1(TGF-β1)对人成熟树突状细胞(mDCs)生物物理特性与迁移能力的影响.方法:用不同浓度TGF-β1(1μg/L、3μg/L、5μg/L、7μg/L)处理mDCs 24 h,按TGF-β1浓度将mDCs分为4组和对照组(未加入细胞因子);采用细胞渗透脆性实验检测mDCs的渗透脆性(未破碎细胞百分率),通过细胞电泳实验测定mDCs电泳率,荧光偏振实验和微吸管系统分别测定mDCs荧光片振度和被吸入管内的长度,以反映mDCs细胞膜的流动性和变形性,利用Transwell系统检测mDCs跨内皮细胞迁移百分率.结果:与对照组相比,(1)细胞渗透脆性,在1μg/L组mDCs破碎百分率增加,5μg/L组mDCs破碎百分率降低,差异有统计学意义(P＜0.05);(2)细胞电泳率,1 μg/L和3μg/L组mDCs电泳率下降,差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01);(3)细胞膜流动性和细胞变形性,细胞膜流动性在5 μg/L组增加;变形能力在5μg/L和7μg/L组增加,差异有统计学意义(P＜0.01或P＜0.05);(4)细胞迁移能力,1μg/L和3μg/L组mDCs跨内皮细胞迁移率下降,差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01).结论:TGF-β1通过影响mDCs的生物物理特性从而抑制其跨内皮细胞迁移的能力.     

Gi蛋白真核表达载体的构建及表达检测

目的:克隆抑制腺苷酸环化酶G蛋白(Gi蛋白)3个亚基α、β和γ基因,构建pEYFP-N-Giα1和pECFP-C-Giβ1-γ2真核表达载体,完成其在真核细胞中的表达检测.方法:培养肝癌细胞HepG2,提取总RNA后反转录成cDNA,通过聚合酶链式反应(PCR)扩增α、β和γ的编码基因,在α亚基两端添加酶切位点,在β和γ亚基两端分别添加酶切位点和连接肽,经酶切和连接得到Giα1和Giβ1-γ2,再将Giα1和Giβ1-γ2基因分别构建到荧光蛋白报告载体pEYFP-N1和pECFP-C1中,利用脂质体法将真核表达载体转染到肝癌细胞中,激光共聚焦显微镜观察分析其表达活性.结果:PCR扩增获得Gi蛋白α、β和γ亚基的编码基因,在两端添加酶切位点和连接肽后获得的Giα1和Giβ1-γ2基因,成功构建了pEYFP-N-Giα1和pECFP-C-Giβ1-γ2真核表达载体,并在肝癌细胞中实现其真核细胞表达.结论:成功构建Gi蛋白的真核表达载体,并鉴定其在活细胞中具有表达活性.     

生理层流剪切力对未成熟树突状细胞microRNA表达谱的影响

目的:探讨生理层流剪切力对未成熟树突状细胞(imDCs) microRNA表达谱的影响.方法:用锥板剪切系统加载10 dyn/cm2的剪切力作用于imDCs 1 h,对照组不加载剪切力,基因芯片技术检测microRNA的表达变化并对其结果进行生物信息学分析.结果:与对照组相比,imDCs在层流剪切力作用后有25个microRNAs表达发生变化,变化倍数＞1.5,差异有统计学意义(P＜0.05);生物信息学分析显示这些变化的microRNA的靶基因主要参与免疫功能调控和细胞对流体剪切力应答相关的信号通路.结论:层流剪切力能够影响imDCs mi-croRNA的表达谱,说明物理因素(剪切力)可能参与了机体的免疫功能调控.     

真菌毒素对树突状细胞免疫应答的影响

真菌毒素是病原真菌产生的次级代谢产物,常污染多种农作物,通过食物链对人畜健康造成严重危害。真菌毒素具有多种毒性作用,包括神经毒性、肝毒性、免疫毒性、致畸性和致癌性等,但其免疫毒性机制尚不完全清楚。树突状细胞（DCs）作为功能最强大的抗原提呈细胞,在启动先天免疫和获得性免疫应答中发挥重要作用。现有研究发现真菌毒素能够影响DCs的内吞作用、刺激T细胞活化的能力以及细胞因子和趋化因子的分泌,本文旨在综述真菌毒素对DCs免疫应答的影响,为后续研究阐明真菌毒素的免疫毒性机制提供参考。