医学微生物学实验线上教学的实践与思考

针对医学微生物学实验线上教学面临的诸多难题,本研究采取线上直播+操作视频+虚拟实验的授课模式,通过操作视频和虚拟实验弥补了操作上的缺口;考核模式采用紧扣操作流程的主观型思考题+实验设计+文献综述（围绕传统实验由于条件所限无法开展的临床检验重头技术或新技术,如质谱分析、荧光定量PCR、G实验等展开）的模式,从而可以较大限度了解学生对教学目标的掌握程度和综合应用、创新性思维等能力。学生调查问卷显示,大部分学生对线上实验教学模式持肯定态度,学生作业的完成质量表明大部分学生学习效果良好。     

巨细胞病毒感染人脐静脉内皮细胞后RAGEmRNA的时序性表达及其意义

目的：研究人巨细胞病毒(HCMV)感染对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)糖基化终产物受体(RAGE)表达的影响，探讨HCMV感染致动脉粥样硬化的作用机制。方法：用HCMV感染HUVEC，采用RT PCR方法检测不同感染时段细胞RAGEmRNA的表达。结果：HCMV感染HUVEC后，0?h时RAGEmRNA有基础水平的表达，4?h开始升高，8?h时表达水平明显升高，随感染时间延长，表达量逐渐增高，感染24?h时达高峰，48?h开始回落，72?h表达量仍维持在较高的水平，显著高于0?h。各时段与0?h比较，均有统计学意义(P＜0.01)。结论：HCMV感染人脐静脉内皮细胞后能够促进RAGE mRNA的表达，并且呈时间依赖性。HCMV有可能通过上调RAGE介导内皮细胞的炎症反应，促进动脉粥样硬化的发生、发展。     

E型沙眼衣原体MOMP基因重组质粒的构建与表达

目的：构建E型沙眼衣原体（Ct）主要外膜蛋白（MOMP）基因重组真核表达质粒pVAX1-MOMP,为探索安全的E型CtDNA疫苗奠定基础。方法：根据Genebank中E型Ct MOMP基因序列设计引物,用高保真PCR方法从E型Ct基因组DNA中扩增得到约1.1kb的MOMP片段,克隆至pcDNAⅡ载体,测序后亚克隆至表达载体pVAX1,构建卡那霉素抗性真核重组表达质粒pVAX1-MOMP,并以重组质粒转染COS-1细胞进行表达,用Western blotting方法鉴定表达产物。结果：从E型Ct基因组DNA中扩增出特异的MOMP基因片段,酶切鉴定及DNA序列测定证实pVAX1-MOMP重组质粒构建正确,能在COS-1细胞内表达,表达产物能与抗MOMP单克隆抗体特异性结合。结论：成功构建E型沙眼衣原体MOMP真核表达质粒pVAX1-MOMP,并在真核细胞内获得表达。     

人巨细胞病毒和糖基化终产物共同作用对血管内皮细胞的影响

目的：观察人巨细胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）和糖基化终产物（advanced glycation end products, AGEs）共同作用对血管内皮细胞（vein endothelial cells，ECV）氧化应激的影响及对糖基化终产物受体（the receptor for advanced glycation end products, RAGE）表达的影响，明确HCMV和AGEs在致内皮细胞损伤作用中是否具有协同效应，探讨HCMV和AGEs致动脉粥样硬化 （AS）发生和发展的可能机制。方法：用HCMV和AGEs分别及共同作用于ECV，将实验对象分为：对照组、HCMV组、牛血清白蛋白（BSA）组、AGEs组、AGEs＋HCMV组5组；用激光共聚焦显微镜检测细胞内活性氧（ROS）的改变；采用RT-PCR方法检测血管内皮细胞RAGEmRNA的表达。结果：HCMV感染ECV后，对照组荧光强度和BSA组荧光强度均较弱，两组间比较差异无统计学意义（P>0.05）；AGEs组和HCMV组荧光强度强于对照组（P<0.01）；AGEs＋HCMV组荧光强度高于AGEs组和HCMV组（P<0.05），两者联合作用存在协同效应。对照组和BSA组ECV细胞RAGEmRNA均有低水平表达，两组之间比较无差异（P>0.05）；AGEs组和HCMV感染组RAGEmRNA表达量高于对照组（P<0.01）；AGEs＋HCMV组表达量高于AGEs组和HCMV组（P<0.01）。在相同病毒滴度感染的情况下，随AGEs浓度增加RAGEmRNA的表达增高，呈浓度依赖性；在相同AGEs浓度作用时，随HCMV感染滴度增加RAGEmRNA的表达水平升高，呈滴度依赖性。各组之间比较差异有统计学意义（P<0.05）。结论：HCMV和AGEs均能够增强血管内皮细胞氧化应激，促进RAGEmRNA的表达，两者共同作用时呈协同效应。HCMV和AGEs有可能通过协同增强氧化应激、进一步上调RAGEmRNA的表达，介导血管内皮细胞的炎症反应，促进动脉粥样硬化的发生、发展。     

优化密码沙眼衣原体主要外膜蛋白基因的设计合成与表达

目的：设计合成优化密码沙眼衣原体主要外膜蛋白(MOMP）基因，克隆构建优化密码MOMP(HuMOMP)基因的真核表达质粒及EGFP—HuMOMP融合基因表达质粒。方法：利用软件分析比较鼠肺炎沙眼衣原体(MoPn)与人类等哺乳动物基因组密码子使用的差异，根据所得数据对MOMP基因进行优化设计与合成。双酶切pUC—HuMOMP质粒，游离HuMOMP片段，定向克隆入pcDNA3的相应位点，构建重组真核表达质粒pcDNA3-HuMOMP；双酶切游离pcDNA3-HuMOMP中的HuMOMP片段，定向克隆入pEGFP—Cl的相应位点，构建重组真核表达质粒pEGFP—HuMOMP；pEGFP-HuMOMP质粒体外脂质体转染COS—1细胞，24h后观察荧光蛋白的表达。结果：合成的HuMOMP基因全长1125bp，经DNA测序无误。酶切鉴定pcDNA3-HuMOMP及pEGFP—HuMOMP质粒获得预期分子量DNA片段：EGFP—HuMOMP融合基因在COS—1细胞中获得明显表达，表达产物定位于胞浆。结论：设计合成的优化密码HuMOMP基因能够在哺乳动物细胞中成功表达。     

大蒜素与两性霉素B体外联合应用抑制白色念珠菌菌丝形成的研究

目的  研究大蒜素与两性霉素B体外联合应用对白色念珠菌菌丝形成的抑制作用,并检测联合应用时细胞毒性的变化。方法  采用微量稀释法测定两类药物联合抗白色念珠菌的作用,采用FICI法对联用结果进行评价。用10％小牛血清RPMI 1640培养基诱导菌丝形成,检测大蒜素与两性霉素B联合应用对白色念珠菌芽管率和菌丝形成的影响。通过对细胞形态的观察及MTT法检测联合用药后对人宫颈上皮细胞H8毒性的变化。结果  两种药物联用对白色念珠菌表现为协同作用,大蒜素能够加强两性霉素B抑制菌丝形成的能力,联合用药后能够显著降低对H8细胞的毒性。结论  大蒜素能够提高两性霉素B抗白色念珠菌的作用,是临床上减少两性霉素B用量,减轻其副作用的最佳选择。     

山东省部分献血员中人疱疹病毒8型感染的血清流行病学调查

人疱疹病毒8型（HHV－8）目前被认为是卡波肉瘤（KS）的致病因子，其引起的KS在艾滋病患者中发病率高达50％。流行病学研究认为，HHV－8在其他人群中也有不同程度的流行。为了解HHV-8在山东地区人群中的感染情况，我们首先在献血人员中进行了HHV－8感染的血清学检测分析。     

嗜酸乳杆菌对生殖道上皮细胞的黏附和黏附拮抗作用的研究

目的　比较热灭活状态和活菌状态乳酸杆菌对生殖道上皮细胞的黏附性及其对生殖道常见致病菌白色念珠菌和加德纳菌的黏附拮抗作用。方法　运用光镜和电镜分析嗜酸乳杆菌活菌和热灭活两种生物状态对刮取的阴道上皮细胞和传代培养的宫颈上皮细胞系HeLa细胞的黏附指数以及经两种生物状态嗜酸乳杆菌拮抗作用后致病菌的黏附指数的变化 ,并用台盼蓝染色法比较二者黏附HeLa细胞后对细胞存活率的影响。结果　两种生物状态的嗜酸乳杆菌对刮取的阴道上皮细胞的黏附不存在显著性差异 ,而热灭活状态对HeLa细胞的黏附指数显著高于活菌状态 ,两种生物状态的嗜酸乳杆菌对白色念珠菌和加德纳菌均有黏附抑制作用 ,热灭活状态嗜酸乳杆菌黏附HeLa细胞在一定时间内不降低细胞存活率。结论　经热灭活的嗜酸乳杆菌对生殖道上皮细胞有较强的黏附性并可对女性生殖道常见致病菌发挥黏附拮抗作用。     

巨细胞病毒感染致人脐静脉内皮细胞E选择素时序性的表达

目的：观察人类巨细胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）作用于血管内皮细胞（vein endothelial cells，ECV）对E选择素时序性的表达，探讨HCMV感染致动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）发生和发展的可能机制。方法:用HCMV感染ECV，采用RT-PCR方法检测不同感染时段细胞E选择素mRNA及蛋白的表达。结果:HCMV感染ECV后，感染0h时E选择素mRNA有基础水平的表达，4h升高并达高峰，8h时开始回落，12h回落显著，24h回落更明显，与0h比较，差异均有统计学意义（P＜0.01），48h接近0h表达水平（P＞0.05）。结论:HCMV感染ECV后能够促进E选择素表达，并且呈时间依赖性。HCMV有可能通过上调E选择素的表达，介导ECV的炎症反应，促进AS的发生、发展。     

济南地区献血者中人疱疹病毒8型（HHV 8）IgG抗体的检测及相关危险因素分析

目的：了解人疱疹病毒8型（HHV 8）在济南地区不同献血者中的感染情况，并对其与年龄、性别、HBV、HCV、梅毒螺旋体的相关性进行统计学分析。方法：以HHV 8 ORF K8.1合成多肽为抗原，采用ELISA方法检测献血者血清中相应IgG水平。结果：520份血清中抗HHV 8 ORFK8.1抗体的总体检出率为5.962%（31/520），有随年龄增加而增高的趋势，但与性别、HBV、HCV、梅毒螺旋体的相关性无统计学意义。结论：济南地区献血者中有一定比率的HHV 8感染。采取措施，防止HHV 8经输血传播具有一定的现实意义。