小儿巨细胞病毒性肝炎治疗的临床对照研究

目的　探讨小儿巨细胞病毒 (HCMV)肝炎的有效治疗方法。方法　将诊断为小儿HCMV肝炎的 2 5例分为治疗组和对照组 ,对照组给予泼尼松、肝太乐、消炎利胆片及苯巴比妥等 ,治疗组在此基础上给予更昔洛韦 (GCV) 静脉用免疫球蛋白 (IVIG) ,分别在治疗前、出院时检查血常规、肝功能和HCMVDNA拷贝数 ,并在出院后 3个月、6个月、9个月随访 ,检查患儿的症状、体征和HCMV定量。结果　治疗组在 5个时点 (治疗前、出院时、3个月、6个月、9个月 )HCMVDNA拷贝数明显下降 ,治疗组和对照组之间用药前后比较 ,在住院天数、黄疸开始消退时间及黄疸完全消退时间的差异有显著意义 ,治疗组输血率明显减少 (P <0 0 5 )。结论　GCV联合IVIG治疗小儿HCMV肝炎能明显降低病毒量 ,缩短病程 ,减轻症状 ,又可纠正贫血 ,减少输血机会 ,未见明显副作用。     

冠状静脉逆灌注对犬缺血心肌的保护作用

【目的】探索一种简便的冠状静脉逆灌注方法,了解其有效性和安全性。【方法】健康成年犬13条,随机分为逆灌注组（n=7）和对照组（n=6）。开胸结扎左冠状动脉前降支（LADA）,逆灌注导管经右颈外静脉送入冠状静脉窦并进一步插至心大静脉（GCV）远端,动脉血由左颈总动脉引出,以自身动脉血压为动力进行持续逆灌注。逆灌注组于LADA结扎后5min开始持续逆灌注,共6h;对照组同样进行插管但不灌注。观察血流动力学、心电图、血清生化及形态学改变。【结果】逆灌注组血流动力学较稳定（P＜0.05～0.01）。LADA结扎后两组缺血中心区心外膜心电图ST段均明显抬高,30min后逐渐回降,逆灌注组回降速度较快（P＜0.01）。与逆灌注组相比,对照组血清肌酸激酶-MB（CK-MB）明显升高,一氧化氮（NO）水平明显下降（P＜0.05～0.01）。对照组和逆灌注组缺血心肌发生梗死的面积分别占（76.2±4.7）%和（38.8±7.3）%（P＜0.01）。光镜下,逆灌注组前室间静脉（LADV）及其小属支内膜结构完整,无明显损伤;两组均未见到出血性梗死。【结论】采用简便的冠状静脉逆灌注方法可明显减轻心肌的缺血性损伤,减小心肌梗死面积,稳定血流动力学,且对冠状静脉系统及心肌组织无明显损伤。     

司坦唑醇对促性腺激素释放激素拟似物处理后的青春期大鼠生长板软骨细胞IGF-1 mRNA表达及其蛋白合成、分泌的影响

目的研究司坦唑醇（stanozolol,ST）对促性腺激素释放激素拟似物（gonadotropin releasing hormone agonist,GnRHa）处理后的离体青春期大鼠生长板软骨细胞胰岛素样生长因子-1（insulin-like growth factor-1,IGF-1）mRNA表达及其蛋白合成、分泌的影响。方法将6只雌鼠的原代软骨细胞,分为时效组、量效组。根据是否用司坦唑醇干预,将时效组和量效组分为时效干预组,时效对照组;量效于预组,量效对照组,分别观察司坦唑醇的干预时限和剂量对促性腺激素释放激素拟似物处理后离体青春期大鼠生长板软骨细胞增殖的影响。采用软骨细胞增殖能力测定法（MTT）和免疫组化法检测不同剂量、不同时间点司坦唑醇处理的离体的青春期大鼠生长板软骨细胞的增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）表达,荧光实时定量RT—PCR检测软骨细胞的IGF-1 mRNA表达。酶联免疫吸附法（enzyme—linked immunosorbent assay,ELISA）测定胰岛素样生长因子-1的合成。结果司坦唑醇以时效和量效作用方式,对雌激素受抑的离体青春期大鼠生长板软骨细胞增殖呈双相型影响。在合适的剂量和疗程时,软骨细胞增殖效应可达最好效果。①司坦唑醇作用2h后,软骨细胞IGF-1 mRNA表达显著增加,与时效对照组基础值相比,差异有显著意义（P〈0．05）,并存在较强的时间依赖性;作用8h时,达最高峰（为时效对照组基础值的3．8倍）。司坦唑醇的作用在（10^-10～10^-5）mol／L时,与软骨细胞的细胞核抗原增殖效应存在明显的剂量依赖性（组间比较,差异有显著意义,P〈0．05）;在10^-7mol／L时,软骨细胞的增殖细胞核抗原表达达最高峰（为基础值的5．75倍）。②司坦唑醇作用自5h起,软骨细胞胰岛素样生长因子-1蛋白合成与时间点为0组比较,差异有显著意义（P=0．042）;5h-20h时,作用存在显著时间依赖性（P〈0．05）;作用20h时,达峰值（为量效对照组基础值的3．3倍）。与量效对照组比较,司坦唑醇自10^-10mol／L组,胰岛素样生长因子-1蛋白含量开始增加,并在10^-7mol／L组达峰值（P=0．000）。结论司坦唑醇可以量效、时效的作用方式,影响和增加对促性腺激素释放激素拟似物处理后的体外培养雌激素水平,促进青春期大鼠生长板软骨细胞IGF-1 mRNA的表达和胰岛素样生长因子-1的合成、分泌,推测司坦唑醇促进生长效应机制与生长板局部胰岛素样生长因子-1的自分泌、旁分泌增加有关。     

小于胎龄儿临床分型及其与先天HCMV感染的相关性研究

[目的]探讨先天人巨细胞病毒(HCMV)感染对胎儿宫内生长发育的影响。[方法]对88例小于胎龄儿(SGA)用酶联免疫吸附法和:PCR法分别检测血HCMV特异性IgM抗体及尿HCMV-DNA,并对SGA及其不同临床分型与先天HCMV感染的相关性进行分析。[结果]①88例SGA中按体质量指数分匀称型占89.77％(79/88),按身长/头围比值分匀称型占85.23％(75/88),两种分型方法结果的符合率为78.4％;而按SGA定义分型,其匀称型为57.95％(51/88)。②SGA的先天HCMV感染率与正常足月儿和早产适于胎龄儿相比,差异有显著性统计学意义(P<0.001)。③按体质量指数和按身长/头围比值分型,其匀称型与非匀称型SGA的先天HCMV感染率差异均无统计学意义(P>0.05)。但按SGA定义分型,其匀称型与非匀称型SGA的先天HCMV感染率差异有统计学意义(P=0.022)。[结论]本文结果提示:①该研究SGA的匀称型比率偏高;②先天性HCMV感染与SGA的发病密切相关。③SGA匀称型比率偏高的原因,可能与我国孕妇孕早期感染发病率高有关。④与按SGA定义分型相比,我国目前的体质量指数及身长/头围比值分型方法对匀称型诊断的正确率过低,提示后者的分型标准值得进一步探讨。     

GH与EGFR受体后信号交联在GH促进青春期大鼠生长板软骨细胞增殖中的作用

目的: 观察促性腺激素释放激素类似物(GnRHa)处理后青春期大鼠生长板体外培养的软骨细胞内是否存在生长激素(GH)与表皮生长因子受体(EGFR)之间的信号交联(cross-talk)。方法: 3周龄雌性SD大鼠开始注射GnRHa至7周龄;随后分离培养5-8只大鼠胫骨生长板软骨细胞,在GH作用前分别加入JAK2阻断剂AG490(1 nmol/L、10 nmol/L和100 nmol/L)、EGFR酪氨酸激酶阻断剂AG1478(0.1 nmol/L、1 nmol/L和10 nmol/L)和表皮生长因子(EGF)中和抗体(0.1 mg/L、1 mg/L和10 mg/L);采用四氮甲基唑蓝(MTT)以及免疫组化法测定增殖细胞核抗原(PCNA),观察不同阻断剂对软骨细胞增殖的影响;采用Western blotting检测软骨细胞p-ERK1/2及p-EGFR的表达。结果: GH作用后具有浓度依赖性地促进软骨细胞增殖和增加p-ERK1/2及p-EGFR水平的作用,100 μg/L时作用最为明显。AG490及AG1478几乎能完全抑制GH促进软骨细胞增殖和激活ERK1/2及EGFR的作用。 而EGF中和抗体仅能部分抑制GH的作用。结论: GH通过激活JAK2而激活其下游的ERK通路,实现其直接促细胞增殖效应。GH亦能通过激活EGFR及其信号转导通路促进细胞增殖效应,表明GH通路和EGF通路间存在相互作用。     

生长激素对促性腺激素释放激素拟似物处理后的青春期大鼠生长板软骨细胞增殖和表型的影响

目的研究生长激素（GH）对促性腺激素释放激素拟似物（GnRHa）处理后的离体青春期大鼠生长板软骨细胞增殖和表型的影响。方法采用两步酶消化法分离培养经GnRHa处理后的5～8只雌鼠胫骨生长板软骨细胞,用四氮甲基唑蓝（MTT）、流式细胞仪测定细胞周期以及免疫组化法测定增殖细胞核抗原（PCNA）和胶原Ⅱ（ColⅡ）的表达,观察不同作用时间和不同剂量的GH对软骨细胞增殖和表型的影响。结果 GH能促进体外培养GnRHa处理后的青春期大鼠生长板软骨细胞的增殖,并存在一定的时效和量效关系。GH作用后第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天组与对照组比较有统计学意义（P〈0.05）,并以第4天时的促增殖效应最强。GH浓度低时（10ng/ml,20ng/ml）促增殖效应不明显（P〉0.05）,而浓度增加至50ng/ml时促增殖效应开始显现（P〈0.05）,至100ng/ml时促增殖效应最明显。GH亦能促进ColⅡ的表达,以GH作用后第4天,浓度为100ng/ml时ColⅡ的表达最强。结论 GH能以直接作用的方式促进体外培养的经GnRHa处理后的大鼠胫骨生长板软骨细胞的增殖和ColⅡ的表达,GH促增殖的剂量与临床应用剂量存在一致性,为GH克服GnRHa使用过程中所造成的生长减速提供了实验理论依据。     

人巨细胞病毒抑制人巨核系祖细胞增殖的体外研究

目的 探讨人巨细胞病毒（HCMV）对人巨核系祖细胞增殖的影响。方法 收集20份脐血标本,采用巨核系祖细胞体外半固体培养技术,观察HCMV AD169株对巨核细胞集落形成单位（CFU－MK）生长的影响,分别用原位聚合酶链反应（IS－PCR）和RT－PCR检测集落细胞中的HCMV DNA与抑刻早期抗原（IEA）mRNA。结果 HCMV AD169株在体外能明显抑制CFU－MK生长,抑制程度与病毒感染滴度呈剂量依赖关系,经IS－PCR检测发现病毒感染组CFU－MK细胞中有HCMV DNA存在;RT－PCR检测发现病毒感染组CFU－MK细胞中有IEAmRNA的表达。结论 HCMV AD169株可直接感染巨核系祖细胞,并抑制其增殖与分化;HCMV对巨核系祖细胞的直接抑制作用可能是该病毒感染后引起血小板减少的原因之一。     

司坦唑醇激活大鼠生长板软骨细胞雌激素受体α、胰岛素样生长因子1受体和细胞外信号调节激酶1/2的交联对话

目的 探讨司坦唑醇(ST)对离体培养的促性腺激素释放激素拟似物(GnRHa)处理后青春期大鼠生长板软骨细胞的作用及其分子层面机制.方法设计并处理后获得胫骨原代软骨细胞,采用免疫组织化学法,检测ST处理后软骨细胞核增殖细胞核抗原(PCNA)的表达;采用WesternBlot法,分析ST作用后软骨细胞雌激素受体α(ERα)、雄激素受体(AR)、胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)及细胞外信号调节激酶(ERK1/2)表达的改变.结果 (1)ST处理后,PCNA呈阳性的细胞明显增加,与0 d组(0.05%)比较,1 d、2 d、3 d组的阳性率差值显著增加(分别为11.0%,24.0%,14.0%).(2)延长ST作用时间和增加ST浓度,AR均未能被激活.ST作用后磷酸化(P)-ERα、p-IGF-1R、p-ERK1/2表达上调,并存在时间和浓度依赖;ERα或丝裂原激活蛋白激酶激酶(MAPK)被阻断后,ST所致的p-ERα表达较未阻断时减弱(1.18±0.07、2.35±0.05;1.45±0.17、2.77±0.39,P均<0.05);ERα或IGF-1R阻断后的p-IGF-1R较ST组显著减弱(4.42±0.42、8.00±0.30;0.77±0.17、11.37±0.97,P均<0.05);MAPKK或IGF-1R被阻断后p-ERK1/2较未阻断组显著减弱(0.61±0.14、9.26±0.92;4.27±0.76、8.59±0.52,P均<0.05).结论 ST可以促进软骨细胞增殖,其作用主要经ERα介导,包括了经典的与ERα以配体结合方式和以非配体激活的MAPK途径,并同时激活IGF-1R,实现其促长骨生长板软骨细胞生长和成熟的生物效应.     

大鼠胫骨生长板软骨细胞的体外培养及鉴定

[目的]建立体外培养及鉴定大鼠胫骨生长板软骨细胞的方法.[方法]采用胰酶和Ⅱ型胶原酶序贯消化法对5～8只3周龄SD大鼠胫骨生长板软骨行体外分离、培养并传至第6代、观察各代软骨细胞形态,MTT法绘制细胞生长曲线,Ⅱ型胶原免疫组化染色,阿力新蓝染色检测各代软骨细胞外基质硫酸糖氨多糖(GAG)含量和结构,采用逆转录聚合酶链反应检测各代细胞Ⅱ型胶原和aggreacan mRNA表达水平.[结果]体外培养的软骨细胞随着传代次数的增加,细胞形态由原代的多角形逐渐变为长梭形;MTT比色法显示,4代以前的软骨细胞的生长曲线近似"S"形,在第4～8天细胞呈对数生长,在第9～10天达平台期,至第11天开始出现生长抑制.4代以前的软骨细胞Ⅱ型胶原免疫组化呈强阳性.原代至第6代软骨细胞的GAG含量、长链分子百分比分别为0.35±0.04,(83.0±3.6)%;0.33±0.02,(78.7±4.2)%;0.31±0.06,(77.7±2.3)%:0.30±0.05,(77.0±5.3)%;0.14±0.01,(44.3±4.0)%;0.10±0.01,(39.3±2.5)%及0.07±0.01,(28.0±2.0)%,显示从第4代后随着传代次数的增加逐渐下降(P<0.05),Ⅱ型胶原和aggreacan mRNA表达水平亦显著减少(P<0.05).[结论]本研究所采用的软骨细胞分离和培养的方法,能在短时间内获得高纯度和高存活率的软骨细胞,第3代及以前的细胞保留了软骨细胞的表型特征,增殖较快,这一方法为更深入地从细胞水平研究儿童的生长提供了可靠有效的模式.