髓系特异性Spi1基因敲除小鼠的构建和基因鉴定

目的 构建髓系特异性Spi1基因敲除小鼠并分析其基因型,为疾病病理机制及药物靶点研究提供动物模型基础。方法 根据CRISPR/Cas9技术原理和Cre/LoxP系统,设计并构建sgRNA和Donor载体,以第2号外显子(Exon 2)所在的转录本为敲除区域,在Exon 2两侧各放置同向Loxp元件;将Cas9蛋白、sgRNA和Donor载体混合显微注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中,移植受精卵到假孕的C57BL/6J母鼠的子宫中,19～20 d后获得F0代。将阳性F0代小鼠与C57BL/6J小鼠交配,得到稳定的F1代Spi1^flox/+小鼠。F1代Spi1^flox/+小鼠雌雄自交得到Spi1^flox/flox小鼠。Spi1^flox/flox与Lyz2-Cre⁺小鼠交配得到Spi1^flox/+/Lyz2-Cre⁺小鼠,再将其与Spi1^flox/flox交配,得到的Spi1^flox/flox/...     

T细胞条件性敲除Spi1基因小鼠的繁育及鉴定

目的 繁育T细胞条件性敲除Spi1基因的小鼠并对其进行鉴定,为进一步探索Spi1编码蛋白PU.1的作用提供研究基础。方法 将Lck-Cre小鼠与Spi1^flox/flox小鼠进行杂交繁育,通过聚合酶链式反应(PCR)和琼脂糖凝胶电泳鉴定小鼠基因型,筛选出基因型为Lck-Cre×Spi1^flox/flox的小鼠即为T细胞条件性敲除Spi1基因的纯合子小鼠。使用磁珠分选脾脏T淋巴细胞,并应用Westernblot、实时荧光定量PCR(qPCR)及流式细胞术检测PU.1在T细胞中的敲除效率。结果 Lck-Cre×Spi1^flox/flox小鼠基因稳定遗传。与Spi1^flox/flox小鼠相比,Lck-Cre×Spi1^flox/flox小鼠脾脏T细胞中的PU.1表达水平显著降低。结论该研究应用Cre/LoxP系统和CRISPR/Cas9技术成功构建了T细胞条件性敲除Spi1基因小鼠,为后续研究PU.1在T细胞相关疾病中的具体作用提供了可靠的动物模型。     

一种靶向HER2嵌合抗原受体CAR THP-1细胞系的构建

目的 获得稳定转染靶向人类表皮生长因子2(HER2)的嵌合抗原受体巨噬细胞(CAR-M)。方法 构建靶向HER2的CAR慢病毒载体并感染人单核细胞白血病细胞系(THP-1)。通过分选流式细胞仪分选出含有绿色荧光标记的CAR THP-1细胞并在体外继续培养。将此靶向HER2的CAR THP-1细胞与HER2表达阴性(-)及阳性(+)的子宫内膜癌细胞系Ishikawa分别共培养，通过成像流式细胞仪检测其对HER2表达阳性肿瘤细胞的靶向吞噬，通过流式细胞仪检测其对HER2表达阳性肿瘤细胞的靶向吞噬比例。结果 CAR慢病毒感染THP-1细胞效率较低；与癌细胞共培养后，流式细胞术及成像流式细胞术结果显示，CAR THP-1组与空载体组相比，CAR THP-1细胞对HER2阳性的Ishikawa细胞吞噬能力增强(P<0.01)。结论 通过构建CAR慢病毒载体并转染THP-1细胞，成功建立了靶向HER2的CAR THP-1细胞系，且其能通过特异性靶向吞噬HER2阳性Ishikawa细胞。