OAZ1基因稳定表达SCC15细胞株的构建及其对舌鳞状细胞癌上皮间质化的影响

目的 探索鸟氨酸脱羧酶抗酶(OAZ1)对舌鳞癌细胞株SCC15上皮间质化的影响及相关机制.方法 构建框移位点突变的OAZ1过表达慢病毒表达载体pLVX-Neo-OAZ1-IRES-ZsGreen,包装病毒并感染SCC15细胞,采用有限稀释法挑取荧光强度较高的单克隆细胞株;利用RT-PCR和Western blot检测OAZ1以及上皮间质化相关基因(E-cadherin、Vimentin、N-cadherin、Zeb1、Snail、Twist1、TGF-β1、Smad1)的mRNA水平和蛋白水平.结果 成功构建了OAZ1基因稳定表达的SCC15细胞株,且OAZ1的过表达可以抑制Vimentin、N-cadherin、TGF-β1的mRNA和蛋白水平表达;此外,OAZ1可以促进Smad1的蛋白水平降低.结论 OAZ1可以抑制舌鳞癌细胞的上皮间质化,其机制可能涉及TGF-β1信号通路和Smad1信号通路的抑制.     

人MUC5AC启动子荧光报告基因的构建与分析

目的：构建人MUC5AC启动子荧光报告基因并进行分析。方法 PCR技术克隆人MUC5AC启动子[(-1300)~(+48) bp]长度片段的基因,将纯化的PCR产物与T载体连接,然后将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,并利用酶切和测序进行重组质粒鉴定;将该重组质粒克隆至pGL3-ehancer荧光报告基因载体上,用脂质体转染法将荧光报告基因转染至人支气管上皮细胞(16HBE细胞),分别用1 ng/mL的重组细胞因子IL-4和IL-13刺激细胞24 h,并设不做任何处理的对照组;用Promega双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测相对荧光素酶活性(Rlus1/Rlus2)。结果人MUC5AC启动子荧光报告基因构建成功,IL-4和IL-13刺激组的相对荧光素酶活性均高于对照组[IL-4(21.6667±2.08167),IL-13(26.5678±1.52753),对照组(8.33±1.52753);F=89.815,P=0.000]。结论 MUC5AC启动子核心区域为(-1300)~(+48) bp范围,IL-4和IL-13可作用于该区域并促进MUC5AC高表达。     

1,25-二羟维生素D3通过TGF-β1（/ Smad2/3）影响的ROS调节气道重塑 #br#

目的 探讨 1，25-二羟维生素 D3［1，25-（OH）2D3］通过转化生长因子-β1（TGF-β1）（/ Smad2/3）对活性氧 （ROS）的影响及调节气道重塑的分子机制。方法 选取健康雌性 Balb/c小鼠 24只，随机分为正常组（A组）、哮喘组 （B组）、1，25-（OH）2D3+哮喘组（C组）。B组和 C组于第 0、7、14天腹腔注射 0.5 mL致敏液（10 µg卵清蛋白与 2 mg铝制剂），之后用卵清蛋白雾化吸入，于第 21~27天每天雾化 1次，第 28~77天隔天雾化 1次制备小鼠支气管哮喘气道重 塑模型。C组在每次雾化激发前 30 min予以腹腔注射 100 ng 1，25-（OH）2D3，实验过程持续至少 77 d。收集小鼠肺组 织分别用于 HE染色、AB-PAS染色、Masson染色分析小鼠气道病理形态改变、气道黏液高分泌及气道重塑，运用计算 机图像分析系统评价各组气道重塑情况。用免疫荧光检测气道 ROS的表达，Western blot检测 TGF-β1、Smad2/3的表 达水平。结果 B组较 A组气道受损明显，可见大量炎性细胞浸润，黏液分泌增加，上皮下胶原沉积明显增多，与 B 组相比，C组病理形态损伤表现明显缓解，但仍较 A组加重；B组较 A组 ROS，TGF-β1、Smad2/3蛋白的表达水平明显 升高。与 B组相比，C组 ROS，TGF-β1、Smad2/3蛋白的表达降低，但仍较 A组升高（P＜0.01）。结论 1，25-（OH）2D3 可能通过抑制 TGF-β1（/ Smad2/3）的表达从而减少 ROS水平，达到调节小鼠气道重塑的作用。     

鼻内滴注烟草提取物和脂多糖建立慢性阻塞性肺疾病小鼠模型的评价

目的：建立鼻内滴注烟草提取物（CSE）和脂多糖（LPS）制备慢性阻塞性肺疾病（COPD）小鼠模型,并探讨其可行性。方法：24只C57BL/6J雄性小鼠随机分为对照组和模型组,每组12只,鼻内滴注CSE和LPS建立COPD小鼠模型,测定2组小鼠支气管肺泡灌洗液（BALF）中细胞总数、中性粒细胞数和巨噬细胞数,观察2组小鼠肺组织病理学表现并测定PAS阳性细胞数、肺泡平均内衬间隔（MLI）和肺泡破坏指数（DI）,Western blotting法检测2组小鼠肺组织中E-cadherin、Vimentin和α-SMA蛋白表达水平。结果：实验4和6周时模型组小鼠BALF中细胞总数、中性粒细胞数和巨噬细胞数明显高于对照组（P<0.01）,模型组小鼠肺组织出现典型粘液高分泌和肺气肿改变;实验4和6周时模型组小鼠PAS阳性细胞数、肺泡MLI （P<0.01）和DI （P<0.01）明显高于对照组;与对照组比较,实验4和6周时模型组小鼠肺组织中E-cadherin蛋白表达水平降低（P<0.01）,Vimentin和α-SMA蛋白表达水平升高（P<0.01）。结论：采用鼻内滴注CSE和LPS的方法可在较短时间内建立COPD小鼠模型。     

白藜芦醇对中性粒细胞性哮喘小鼠肺组织炎症的抑制作用及其机制

目的：探讨白芦藜醇对中性粒细胞性哮喘小鼠肺组织炎症的抑制作用,并阐明其作用机制。方法：选取18只C57BL/6J雌性小鼠,采用脂多糖（LPS）+卵白蛋白（OVA）联合致敏方法建立中性粒细胞性哮喘小鼠模型,随机分为模型组（LPS+OVA组）、白藜芦醇组（Res组,于激发前2 h灌胃30 mg·kg^-1白藜芦醇）和N-乙酰半胱氨酸组（NAC组,于激发前2 h灌胃3 mmol·kg^-1 N-乙酰半胱氨酸）;同时选取6只同周龄小鼠作为正常对照组（PBS组）。于乙酰甲胆碱雾化期间观察各组小鼠的行为学变化,采用肺功能仪分析小鼠气道高反应（AHR）,光学显微镜观察支气管肺泡灌洗液（BALF）中细胞总数和炎症细胞,HE染色观察各组小鼠肺组织病理形态表现,酶联免疫法（ELISA）检测各组小鼠BALF上清中白细胞介素17（IL-17）水平,特异性荧光探针DCF-DA染色分析肺组织活性氧（ROS）水平,丙二醛（MDA）试剂盒检测肺组织匀浆中MDA水平。结果：与PBS组比较,LPS+OVA组小鼠Penh值、细胞总数、炎症细胞、气道炎症及评分均明显升高（P<0.05或P<0.01）,BALF上清中IL-17水平明显升高（P<0.01）,肺组织内ROS荧光强度明显升高,肺匀浆中MDA水平明显升高（P<0.01）。与LPS+OVA组比较,Res组和NAC组小鼠Penh值、细胞总数、炎症细胞、气道炎症及评分明显降低（P<0.05或P<0.01）,BALF上清中IL-17水平均明显降低（P<0.05）,肺组织内ROS荧光强度降低,肺匀浆中MDA水平明显降低（P<0.01）。结论：白藜芦醇能够有效抑制中性粒细胞性哮喘小鼠肺组织中的炎症反应,其机制可能与白藜芦醇抑制体内发生的氧化应激反应有关。     

IL-33通过TGF-β1/Smad3信号通路调控CES诱导细胞上皮-间质转化的机制研究

目的 探讨IL-33在烟草提取物(CSE)诱导细胞上皮-间质转化(EMT)形成过程中的作用机制。方法 将人支气管上皮细胞(16HBE)分为对照组、CSE组、CSE+Anti-IL-33组、CSE+IL-33组,按照实验分组分别给予PBS、5%CSE、5%CSE+Anti-IL-33(3μg/mL)、5%CSE+IL-33(40 ng/mL)刺激72 h。免疫荧光检测细胞E-钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)荧光强度,Western blot检测细胞E-cadherin、Vimentin、肿瘤发生抑制蛋白2(ST2)、转化生长因子-β1(TGF-β1)、母亲信号蛋白同源物(Smad3)、磷酸化Smad3(p-Smad3)蛋白表达。结果 与对照组比较,CSE暴露后干预各组细胞E-cadherin蛋白表达降低,Vimentin、ST2、TGF-β1、p-Smad3蛋白表达升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与CSE组比较,CSE+Anti-IL-33组E-cadherin蛋白表达升高,Vimentin、ST2、TGF-β1、p-Smad3蛋白表达降低,C...     

二氧化硅通过调节人气道上皮细胞自噬促进MUC5AC表达

目的 探讨二氧化硅(SiO₂)对人气道上皮细胞株(Beas-2b)黏蛋白5AC(MUC5AC)表达的影响及其作用机制。方法 用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基在37℃和5%CO₂的培养箱培养Beas-2b。使用NC-siRNA、ATG5-siRNA、BECN1-siRNA及mCherry-EGFP-LC3等慢病毒转染Beas-2b。各转染组细胞用相应慢病毒(MOI=20)转染12 h后换新鲜培养基，并用嘌呤霉素(1μg/mL)进行筛选，获得稳定转染细胞株。用SiO₂(100μg/mL)刺激前述稳定转染细胞株24 h，并设PBS对照组。免疫荧光和免疫印迹检测MUC5AC、自噬相关蛋白5(ATG5)、BECN1和微管相关蛋白轻链3(LC3)的蛋白水平；共聚焦显微镜观察人气道上皮细胞自噬情况。结果 SiO₂组的MUC5AC、ATG5、BECN1和LC3Ⅱ的表达高于对照组(P <0.05);ATG5和BECN1敲减细胞株中，SiO₂刺激后MUC5AC和LC3Ⅱ的表达均低于对照...