两种PCR技术在GDNF基因克隆中的应用

聚合酶链式反应（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ,ＰＣＲ）自１９８５年问世以来在分子生物学领域得到了极其广泛的应用,包括从基因组中大量地扩增单拷贝基因［１,２］,扩增ｍＲＮＡ的ＲＴＰＣＲ［３］,ＰＣＲ测序,ＰＣＲ标记探针,定量ＰＣＲ［...     

人GDNF基因的克隆

目的：克隆可表达人胶质细胞源性神经营养因子的基因。方法：从脑胶质细胞瘤患者术后的脑瘤组织中提取总ＲＮＡ，以ＲＴＰＣＲ方法扩增出了一段约５５８ｂｐ的ｃＤＮＡ片段，将这一片段克隆于ｐＵＣ１８载体中，进行全序列分析。结果：证实该研究所克隆的ｃＤＮＡ是编码正确的人ＧＤＮＦ基因。与发表于ＧｅｎｅＢａｎｋ上的序列相比，发现该研究克隆的基因有一段７８ｂｐ的核苷酸序列缺失，但不影响密码子的阅读框。结论：克隆到了编码正确的人ＧＤＮＦ的ｃＤＮＡ全序列，对帕金森病基因治疗的基础研究及临床应用具有重要意义。     

抑制性消减杂交法分离吗啡依赖大鼠脑内的差异表达基因的初步报道

用递增剂量的吗啡处理SD大鼠,建立吗啡依赖大鼠模型,选取中脑导水管周围灰质、伏核、纹状体等核团,提取总RNA,用抑制性消减杂交( SSH)方法,分离吗啡依赖大鼠的高表达基因,初步获得了4个新基因的cDNA片段,并发现了3 个已知的功能基因在吗啡依赖过程中增高.进一步的研究尚在进行中.     

人GDNF基因的克隆

克隆可表达人胶质细胞源性神经营养因子的基因。方法；从脑胶质细胞瘤患术后的脑瘤组织中提取总ＲＮＡ，以ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增出了一般约５５８ｂｐ的ｃＤＮＡ片段，将这一片段克隆于ｐＵＣ１８载体中，进行全序列分析。结果：证实该研究所克隆的ｃＤＮＡ是编码正确的ＧＤＮＦ基因。     

pcDNA3.0/hTH和 pcDNA3.1/hGDNF共转染SH-SY5Y细胞的克隆筛选和鉴定

我们采用多基因表达技术把携带人胶质细胞源性神经营养因子 (ＧＤＮＦ)和酪氨酸羟化酶 (ＴＨ)基因的重组质粒转入ＳＨ ＳＹ5Ｙ细胞中 ,构建同时分泌人ＴＨ和ＧＤＮＦ的工程细胞 ,为探讨双基因治疗帕金森病 (ＰＤ)提供依据 ,现将结果报道如下。一、材料与方法1.实验材料 :ｐｃＤＮＡ3.0 /ｈＴＨ和ｐｃＤＮＡ3.1/ｈＧＤＮＦ重组质粒 (普林斯顿大学崔振中博士构建 )。真核表达载体ｐｃＤＮＡ3.1:5 .6ｋｂ ,非功能区含ＨｉｎｄⅢ和ＢａｍＨⅠ酶切位点 ,带有抗潮霉素和氨苄青霉素标记基因 ,含有ＣＭＶ启动子和ＳＶ40增强子。细胞培养液 :采用最低…     

GFP转基因指示系统建立的研究

用环磷酰胺分别按１００、１５０、２００和２５０ｍｇ／ｋｇ剂量对小鼠一次腹腔注射，均可使小鼠外周血白细胞在注药后４ｄ降至最低，给药后５ｄ回升，给药后６ｄ超越用药前水平，并维持相当长一段时间。白细胞降至最低的水平与用药剂量呈负相关。对白细胞总数每天的动态变化分析结果提示：能提高此模型小鼠外周血白细胞低峰值的治疗手段，或可视为防止化疗引致外周血白细胞减少症的方法。     

GFP-pl6融合基因表达载体的构建

本文报道了以ＧＦＰ（绿色荧光蛋白）基因为报告基因，ｐｌ６基因为目的基因，将ｐｌ６基因分别插入ＧＦＰ基因的上游和下游，构建成ＧＦＰ－ｐｌ６融合基因表达载体ｐＣｐｌ６Ｇ和ｐＣＧｐ１６，并通过酶切、电泳技术对重组体进行了鉴定。该表达载体的构建成功为开展ｐｌ６转基因动物模型的建立及其特性研究奠定了基础     

GFP-p16融合基因表达载体在BHK HeLa细胞中荧光蛋白表达的研究

本文报道了通过脂质体转染技术将本室构建成的GFP-p16融合基因表达载体——pCp16G和pcGp16分别导入BHK、HeLa细胞中，研究它们在真核细胞中荧光蛋白的表达；结果表明，外源脂质体对BHK、HeLa等真核细胞无损伤，经斑点杂交检测证明，外源基因可以通过脂质体转染技术整合到细胞基因组中。研究结果还表明，p16基因与GFP基因的3′端连接，可以保持GFP的荧光特性，表达荧光蛋白，而与GFP基因的5′端连接，则不能表达荧光。     

用mRNA差异显示法分离大鼠吗啡依赖相关基因

目的：分离并克隆大鼠吗啡依赖相关基因。方法：ＳＤ大鼠用递增剂量的吗啡作皮下注射,形成吗啡依赖的动物模型。分离鼠脑的中脑导水管周围灰质、伏核、纹状体等核团,提取总ＲＮＡ,用ｍＲＮＡ差异显示（ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｌｄｉｓｐｌａｙＰＣＲ,ＤＤＰＣＲ）的方法,筛选吗啡依赖大鼠特异表达产物的ｃＤＮＡ片段。用３组锚定引物（Ｔ１２ＭＮ,Ｍ＝Ａ,Ｇ,Ｔ或Ｃ,Ｎ＝Ａ,Ｃ或Ｇ）和６组随机引物（ＡＰ１～ＡＰ６）作不同组合进行ＰＣＲ扩增。结果：获得了８０余个差异表达产物的ｃＤＮＡ片段,经斑点杂交初步筛选,克隆了１０个阳性片段,选取４个克隆进行序列分析,获得了４个ｃＤＮＡ片段。结论：通过ＢＬＡＳＴ数据库序列比较,现已确认获得了４个吗啡依赖表达的新基因片段。