鼠抗人OX40功能性单克隆抗体的研制及其生物学特性的鉴定

目的：研制功能性鼠抗人OX40单克隆抗体。方法：以转人OX40的转基因细胞L929-OX40为免疫原，常规免疫6—8周龄的雌性BALB／c小鼠；采用B淋巴细胞融合技术，将免疫小鼠脾脏细胞与SP2／0融合，以L929-OX40转基因细胞及PHA活化的T细胞为抗体筛选阳性细胞，经免疫荧光标记分析对杂交瘤进行反复筛选和多次的克隆化培养；采用快速定性试纸法及竞争抑制结合试验分析了该单抗的亚类及抗原识别位点；采用MTT法分析单抗在体外对T细胞的促增殖效应以及ELISA分析活化T细胞分泌的细胞因子。结果：获得1株持续、稳定分泌鼠抗人OX40单克隆抗体的杂交瘤细胞株(命名为7E11)，该单抗能特异性地识别人OX40分子和介导有效的共刺激信号，体外促进活化的T细胞增殖和细胞因子的分泌。结论：成功研制成一株能分泌功能性鼠抗人OX40单克隆抗体的杂交瘤，该抗体特异性地识别人OX40分子并具有在体外协同刺激T细胞的作用。     

人4-1BBL转基因细胞株的构建及其生物学功能的研究

目的为探讨人4-1BBL分子的生物学功能，构建人4-1BBI。转基因细胞株。方法利用RT-PCR方法克隆人4-1BBI。全长基因，继而重组入逆转录病毒表达载体pEGZ．Term。重组逆转录病毒载体pEGZ．Term／4-1BBI。与两个辅助病毒载体用脂质体法共转染包装细胞293T，用含有完整重组逆转录病毒颗粒的293T细胞培养上清感染L929细胞，筛选获得Zeocin抗性的转基因细胞。^3H-TdR掺入实验分析4-1BBL转基因细胞对T细胞增殖的影响，ELISA法分析细胞因子的分泌。结果流式细胞仪表型分析结果表明，L929／4．1BBL转基因细胞稳定表达人4-1BBL分子。体外实验表明，L929／4-1BBL细胞能够促进T细胞活化、增殖及IL-2、IL-6和IFN-γ的分泌。结论该研究成功克隆了人4-1BBL基因，构建了能稳定表达4-1BBL分子的转基因细胞株L929／4-1BBL，该株转基因细胞能提供有效的4-1BBL共刺激信号，促进T细胞活化、增殖及细胞因子的分泌。     

人PD-L1基因转染细胞株的构建及其对活化的Jurkat细胞增殖和凋亡的影响

目的:构建稳定表达人PD-L1分子的基因转染细胞株,观察其对活化的Jurkat细胞增殖和凋亡的影响。方法:将编码人PD-L1分子的全长c DNA重组入反转录病毒表达载体p EGZ-Term-R,将重组载体p EGZ-Term-R/PD-L1和辅助病毒载体用脂质体法共转染293T细胞,包装具有感染能力的完整病毒;收集含有完整重组反转录病毒的293T细胞培养上清,感染L929细胞,筛选并获得G418抗性的基因转染细胞。采用流式细胞术检测表达PDL1的基因转染细胞,命名为L929/PD-L1。采用PHA活化T细胞系来源的细胞株Jurkat,并将其与丝裂霉素预处理的L929/PD-L1细胞共培养,用细胞计数法观察L929/PD-L1细胞株对活化的Jurkat细胞增殖能力的影响,并检测其凋亡情况。结果:成功获得了稳定表达人PD-L1基因的转染细胞株L929/PD-L1。PHA可诱导Jurkat细胞活化并表达PD-1分子;L929/PD-L1与PHA刺激后的Jurkat细胞共培养,可抑制Jurkat细胞增殖,促进其凋亡。结论:成功构建了稳定表达人PD-L1的细胞株,PD-L1分子抑制活化的Jurkat细胞增殖,促进其凋亡。     

佛波酯对人视网膜神经母细胞瘤Y79细胞株表达CD133的调节作用

目的研究佛波酯（PMA）对人视网膜神经母细胞瘤表达CD133的影响。方法以人视网膜神经母细胞瘤Y79细胞株为研究对象，采用流式细胞术、RT-PCR方法检测PMA刺激后Y79细胞株CD133的表达。结果5ng／ml PMA显著增加CD133的表达，其作用在PMA刺激48h后最为明显。但与此同时，CD133mRNA表达较刺激前明显下降。H-7抑制PMA对Y79细胞的作用。结论PMA能够诱导人视网膜神经母细胞瘤Y79细胞株CD133蛋白表达增加。这一作用主要通过活化蛋白激酶C（PKC）通路来实现，而CD133抗原表达可能是转录后进行调节。     

粒细胞集落刺激因子受体在非小细胞肺癌中的表达及意义

目的 研究粒细胞集落刺激因子受体(G-CSFR)在qP4,细胞肺癌(NSCLC)中的表达及在NSCLC发生、发展中的作用.方法 应用免疫组化SP法检测35例NSCLC及9例肺良性病变组织中G-CSFR的表达;PI单标流式细胞术检测肺腺癌细胞株A549上G42SFR的表达;BRDU标记法检测rhG-CSF对A549细胞的增殖影响及Annexin V-FITC/PI法检测细胞的凋亡.结果 NSCLC中有明显的G-CsFR蛋白表达,并高于肺良性病变组织(P<0.05);G-CSFR 阴性表达与年龄、性别及肿瘤病理分期无关,而与肿瘤大小有关(P<0.05).A549细胞高表达G-CSFR;rhG-CSF对A549细胞的增殖无明显影响,但可抑制其凋亡.结论 G-CSFR在NSCLC中的表达较肺良性病变组织明显上调,G-CSFR的阳性表达与肿瘤大小有关,其表达可能对肿瘤细胞的凋亡有抑制作用,进而促进肿瘤的发生发展.     

共刺激分子4-1BB及其配体4-1BB Ligand(4-1BBL)与肿瘤免疫

1970年Bretscher和Cohn首先提出“T细胞激活双信号”假说以来 ,细胞免疫“双信号”学说得到大量的体外实验的证实[1] 。介导共刺激信号的分子有多种 ,4 1BB与 4 1BBL是其中非常重要的一个成员。4 1BB 4 1BBL介导的共刺激信号可以诱导T细胞的活化、增殖及抗凋亡 ,维持T细胞的长期生存及提高细胞因子的分泌 ,4 1BB还能通过CD2 8非常依赖途径刺激T细胞的增殖并在树突状细胞和单核细胞介导的细胞免疫中起作用。因此 ,4 1BB和其配体 4 1BBL介导的共刺激信号是激发有效的抗肿瘤细胞免疫应答尤其是长期抗肿瘤效应所必需的 ,有望为…     

4-1BBL逆向信号促进单核细胞的增殖和分泌细胞因子的作用

采用抗人 4 1BBL单克隆抗体 1F1包被 2 4孔培养板 ,加入经免疫磁珠阴性选择获得的高纯度人外周血单核细胞 ,动态观察细胞的生长状态 ,并用3 H TdR掺入法分析单核细胞增殖 ,应用ELISA动态测定培养上清中IL 6、IL 10、M CSF和FL等细胞因子水平。结果发现 1F1非常有效地促进单核细胞的增殖 ,1F1组单核细胞分泌高水平的M CSF以及IL 6和FL增加 ,但 1F1组单核细胞分泌IL 10水平低于对照组 (P <0 0 5 )。由此表明 ,抗人 4 1BBL单克隆抗体 1F1通过激发单核细胞 4 BBL逆向信号 ,介导单核细胞分泌M CSF、IL 6和FL。上述细胞因子联合作用 ,从而促进了单核细胞的增殖。     

鼠抗人OX40L功能性单克隆抗体的研制及其生物学特性的鉴定

目的　鼠抗人OX4 0L分子功能性单克隆抗体的研制及其生物学特性的鉴定。方法以高表达人OX4 0L分子的转基因细胞L92 9/OX4 0L为免疫原 ,常规免疫BALB/c小鼠 ,采用B淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合 ,并以L92 9/OX4 0L为阳性抗体筛选细胞 ,L92 9/mock为阴性抗体筛选细胞 ,经免疫荧光标记和流式细胞术分析、反复筛选和多次克隆化培养 ,筛选出特异分泌鼠抗人OX4 0L分子单克隆抗体的杂交瘤细胞株 ;采用Westernblot、Ig亚型快速定性试纸法、间接免疫荧光法、竞争结合抑制试验和3 H TdR增殖试验等对单抗进行生物学特性的鉴定。结果　成功获得 3株持续、稳定分泌鼠抗人OX4 0L单克隆抗体的杂交瘤细胞株 ,命名为 9H10、4C12和 1G1。对单抗的生物学功能的研究结果表明 ,3株单抗均能识别活化B细胞和成熟DC表达的OX4 0L分子 ,且能抑制成熟DC对T细胞的促增殖作用 ,并与阻断型抗人B7 1单抗具有协同作用。结论　获得的 3株分泌鼠抗人OX4 0L功能性单克隆抗体的杂交瘤 ,所分泌的抗体具有特异性地识别人OX4 0L分子并能阻断OX4 0 /OX4 0L共刺激信号及抑制DC对T细胞的激发作用。     

AC133-2分子的克隆及其逆转录病毒表达载体的构建

目的克隆人AC133—2全长基因，构建PGEZ—TerM—AC133—2逆转录病毒表达载体。方法采用分段克隆的方法，通过聚合链式反应从胎肝文库中克隆AC133—2，并构建AC133—2基因的逆转录病毒表达载体。结果成功克隆AC133—2全长基因并构建PGEZ-Term—AC133—2逆转录病毒表达载体。结论AC133—2全长基因克隆及构建逆转录病毒表达载体的成功，为构建AC133—2转基因细胞和制备抗人AC133—2单克隆抗体和研究AC133—2的生物学功能奠定了物质基础。     

"一箭双星法"构建Flt3转基因细胞株

目的构建稳定表达Flt3分子的转基因细胞株。方法将Flt3基因重组入逆转录病毒载体pEGZ-term,通过293T细胞的包装获得具有感染能力的完整重组病毒载体,进而采用“一箭双星法”即同时感染BaF和L929细胞,构建Flt3转基因细胞株。结果成功获得稳定表达Flt3的转基因细胞株BaF/Flt3和L/Flt3。结论采用“一箭双星法”成功构建Flt3转基因细胞株,为以Flt3为靶分子的研究奠定了物质基础,也为类似的高难度的转基因细胞株的构建提供了有价值的经验。