白细胞介素-12基因再修饰基因瘤苗免疫小鼠的脾细胞过继治疗肝癌

目的　探讨白细胞介素 (IL) 2和B7 1双免疫基因转染肝癌细胞瘤苗免疫小鼠后获得的脾淋巴细胞经mIL 12基因修饰后治疗小鼠肝癌的可行性和疗效。方法　用 2 0 0PFU 细胞滴度的重组腺病毒载体 (Adv)将人IL 2和B7 1基因共同转染小鼠肝癌Hepal 6细胞株 ,经 80mg L丝裂霉素 (MMC)处理制备成肝癌细胞瘤苗 ,免疫同系小鼠后分离其脾淋巴细胞 (SLC) ,转染mIL 12基因 (Adv滴度 2 0 0PFU 细胞 )后注射入直径 1cm的小鼠皮下移植肝癌内 ,观察抗瘤效果。结果　转mIL 12基因SLC治疗组小鼠瘤体增加值最小 ( 0 .0 8± 0 .0 5 )cm3,与各对照组比差异有显著性 [(转染BGFP基因SLC、未转染SLC和生理盐水注射组分别为 ( 3 .46± 0 .15 ) ,( 3 .5 6± 0 .2 3)和( 8.12± 0 .5 4)cm3,P <0 .0 5 ]。结论　IL 2和B7 1双基因修饰肝癌瘤苗诱导小鼠产生的免疫脾淋巴细胞可能成为一种新的过继免疫治疗效应细胞及携带IL 12基因的载体细胞 ;基因治疗、特异性主动免疫和过继性细胞免疫治疗结合将有更优越的抗瘤效果。     

肝癌细胞微细胞介导染色体转移方法学的建立与探讨

目的建立肝癌细胞微细胞介导染色体转移方法，为肝癌转移抑制基因的染色体功能定位建立技术平台。方法人单染色体供体细胞通过微核化、出核、融合步骤将随机标记有耐药neo基因的正常人8号染色体导入到大鼠肝癌高转移细胞系C5F中，对微细胞杂交克隆进行药物筛选和单细胞克隆，并填序列标签位点-PCR和全染色体涂染荧光原位杂交方法验证人染色体转移的结果。结果获得具有G418和HAT双重抗性的微细胞杂交细胞，通过单细胞分离克隆方法获得15个具有双重抗性的微细胞杂交克隆，序列标签位点-PCR结果发现导入染色体的随机片段丢失，全染色体涂染荧光原位杂交结果发现导入的人8号染色体与大鼠染色体发生了稳定的重组。结论成功建立微细胞介导的染色体转移技术，为肝癌转移抑制基因的染色体功能定位奠定了技术基础。     

不同转移潜能人肝癌细胞系酪氨酸磷酸化蛋白质差异分析

目的研究不同转移潜能人肝癌细胞系中酪氨酸磷酸化蛋白质表达的差异并筛查与肝癌转移相关的酪氨酸磷酸化蛋白质分子。方法应用双电泳(2-D E)、免疫印迹法及基质辅助激光解析电离飞行时间质谱分析,对三种不同转移潜能人肝癌细胞系Hep 3B、MHCC97L和MHCC97H进行酪氨酸磷酸化蛋白质组分析。结果对照2-DE胶和免疫印迹发光胶片,Hep3B检测到10个点,MHCC 9 7L检测到19个点, MHCC97H检测到17个点。经质谱鉴定,得到膜连蛋白Ⅰ等19个差异点。结论细胞内酪氨酸磷酸化蛋白的表达差异与肝癌的侵袭转移有关。     

微血管张力测定技术在血管内皮去除中的应用

目的通过建立离体小动脉血管内皮去除的研究方法,提高微血管测量技术研究数据的可信度。方法选取♂自发性高血压大鼠(SHR)和正常血压大鼠(WKY),测量血压后,获取肠系膜动脉环。采取机械(血管环围绕电极尖端旋转、推注气体)和药物(L-NAME和吲哚美辛)相结合的方式去除内皮。采用压力肌动图技术检测苯肾上腺素(PE)、乙酰胆碱(ACh)、硝普钠(SNP)对肠系膜动脉直径变化的影响。结果(1)SHR血压值高于WKY大鼠(P<0.01);(2)PE浓度依赖地收缩肠系膜动脉。内皮完整和内皮去除时,与WKY相比,SHR的收缩增强(P<0.05);(3)ACh、SNP能够浓度依赖地舒张肠系膜动脉。内皮完整时,与WKY相比,SHR的舒张减弱(P<0.01);内皮去除时,与WKY相比,SHR的舒张增强(P<0.01)。结论(1)成功建立离体微小动脉血管内皮去除的研究方法。(2)高血压大鼠存在明显的血管舒缩功能障碍。     

乙型肝炎相关肝癌外周血树突状细胞负载肿瘤抗原前后免疫功能的变化

目的探讨肝癌患者外周血单个核细胞(PBMC)来源树突状细胞(DC)表面分子表达及负载肿瘤抗原前后免疫功能变化与免疫逃逸的关系。方法分离18例乙型肝炎相关原发性肝癌、11例乙型肝炎肝硬化患者和10名健康献血者PBMC,体外培养,并加入重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素-4(IL-4)诱导DC。以共聚焦显微镜和扫描电镜观察形态,以流式细胞仪检测DC表面人类白细胞抗原(HLA)-DR、CD1a、CD80、CD83、CD86等分子表达水平。以HCCLM6肝癌细胞株制备肿瘤抗原,分别负载3种DC,最后以混合淋巴细胞反应(MLR)测定DC负载前后刺激同种异型T淋巴细胞增殖能力,并测定MLR上清液中IL-12的含量。结果肝硬化和肝癌组PBMC、DC得率低于正常组(P<0.05);HLA- DR、CD1a、CD80和CD86等分子表达水平也低于正常组(P<0.05);负载肿瘤抗原前肝硬化和肝癌组刺激同种异型T淋巴细胞增殖能力和MLR上清液中IL-12含量明显低于正常组,负载肿瘤抗原后3组均提高, 并以肝硬化组提高最为明显,但IL-12含量仍低于正常组。结论DC表型和功能缺陷可能是乙型肝炎病毒产生免疫耐受和肝癌细胞免疫逃逸的重要机制。肝硬化患者DC仍有一定功能。     

咖啡因促受照射肝癌细胞株MHCC97H凋亡的实验研究

目的观察咖啡因促受照射MHCC97H细胞株凋亡的作用及机制。方法通过流式细胞仪分析不同条件下细胞凋亡比例和周期分布，应用Western Blotting动态观察磷酸化CDC2 Tyr15的表达量，利用细胞克隆集落试验证明咖啡因的放疗增敏效果。结果MHCC97H细胞照射后48小时，0、8、16、24Gy组的凋亡率分别为5．7％、12．0％、19．4％、21．7％；咖啡因促进凋亡，2．5mmol／L咖啡因组的凋亡比例在照射16Gy48小时左右由对照组的19．4％升至32．3％，并且随着时间的推移凋亡比例逐渐增加。辐射引起细胞G2期阻滞，0、8、16、24Gy组的G2期比例分别为13．9％、25．6％、41．4％、51．6％，G2期阻滞的程度与剂量呈正相关；而咖啡因可去除由辐射引起的G2期阻滞，2．5mmol／L咖啡因组的G2期细胞比例在照射12小时左右由对照组的37．6％降为29．6％。MHCC97H细胞照射后，G2期阻滞程度与磷酸化CDC2 Tyr15的表达量一致；咖啡因则抑制磷酸化CDC2Tyr15的表达量。细胞克隆集落试验显示，咖啡因可降低放射后MHCC97H细胞的存活分数，放疗增敏比（SER）为1．28。结论咖啡因通过增加CDC2Tyr15的脱磷酸化，去除由辐射引起的G2期阻滞，从而促进凋亡，达到放疗增敏的效果。     

放疗对人肝癌细胞株HepG_2凋亡的诱导作用

目的:探讨放疗对人肝癌细胞株HepG2细胞凋亡的影响,为放疗的临床应用提供依据。方法:不同剂量的X射线分别照射体外培养的HepG2细胞,照射后48h收集细胞,用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)法和透射电镜分别检测各组细胞的凋亡情况。结果:TUNEL染色显示,2Gy、4Gy、6Gy、8Gy剂量组AI高于假照射组,细胞经4GyX射线照射后具有细胞凋亡的形态学特征。结论:X射线可诱导肝癌细胞HepG2细胞凋亡。     

人原发性肝癌基因的实验研究───肿瘤坏死因子基因的初步应用

将含人肿瘤坏死因子（ＴＮＦα）ｃＤＮＡ的不同逆转录病毒载体（ＬＮＳ－ｔｎｆα、Ｌ－ｔｎｆαＳＮ及ＬＮＣ－ｔｎｆα）和质粒型真核细胞载体（ｐＳＶＫ３－ｔｎｆα），分别用磷酸钙法导入肝癌细胞ＳＭＭＣ－７７２１中，观察ＴＮＦ的表达水平。结果：重组质粒型表达载体ｐＳＶＫ３－ｔｎｆα表达好，２４小时开始分泌ＴＮＦα（５０Ｕ／ｍｌ），４８～７２小时达最高值（９０Ｕ／ｍｌ），９６小时后下降（４０Ｕ／ｍｌ）。将ｐＳＶＫ３－ｔｎｆα重组ＤＮＡ用磷酸钙包裹后直接进行瘤内注射，发现裸鼠外周血ＴＮＦα水平有一过性增高，３周后测量瘤体大小，发现实验组的肿瘤体积明显小于对照组（２．５±１．６ｃｍ比３．２±１．８ｃｍ，ｎ＝６，Ｐ＜０．０５），实验组荷瘤裸鼠的生存时间亦明显延长（４４．０±３．３ｄ比２８．２±２．０ｄ，ｎ＝６，Ｐ＜０．０１）。结果表明，应用ＴＮＦα基因转移进行肝癌的基因治疗是一条值得探索的途径。     

肝癌患者粘附性LAK细胞制备及抗瘤活性研究

本研究在常规LAK细胞制备基础上进行改进，用苯丙氨酸甲酯(PME)去除肝癌患者外周血中抑制LAK细胞活性的单核巨噬细胞。制备抗癌活性较高扩增迅速的粘附性LAK细胞，从实验结果分析。外周血处理后粘附性LAK细胞较未粘性LAK细胞具有较强的扩增能力，最大扩增倍数23～243倍，同时粘附性LAK细胞中TH细胞亚群有增加趋势，Ts细胞亚群有碱少趋势，其IL-2R^ 表达增加至64．3%。此外,在抗瘤活性方面粘附性LAK细胞与非粘附性LAK细胞存在一定差别，分别为64．6%和42．8%．因此。从临床实用出发。制备相对高效的粘附性LAK细胞可以提高LAK疗法的治疗效果。     

硅油填充术后继发性青光眼的原因分析及处理

目的探讨玻璃体切除硅油填充术后发生继发性青光眼的原因及处理方法。方法对29例(29只眼)玻璃体切除硅油填充术后继发性青光眼患者进行总结、分析,讨论其发生原因及处理方法。结果98例玻璃体切除硅油填充眼,继发青光眼29例(29.6%),其原因及处理如下:硅油填充过多,前房变浅,房角粘连,占19.2%,及时取出部分硅油;术后硅油进入前房,引起瞳孔阻滞使眼压升高,占38.9%,调整体位,使硅油退回玻璃体腔或取出前房硅油;术后炎症反应,炎症细胞阻塞小梁网或小梁网水肿使眼压升高,此时积极抗炎治疗;随时间延长,硅油乳化并堵塞小梁网或使小梁网变性,导致眼压升高,占34.9%,及时取出硅油。结论玻璃体切除硅油填充术后继发性青光眼是此类手术的常见并发症,早期预防,及时发现并正确处理会减少视功能的损害。