兔骨髓间充质干细胞的分离、培养与鉴定

背景：目前对骨髓间充质干细胞常用的分离方法有密度梯度离心法、贴壁筛选分离法。目的：联合应用密度梯度离心法和贴壁筛选分离法体外分离培养、扩增兔骨髓间充质干细胞，并对其进行鉴定。设计、时间及地点：对比观察的细胞学实验，于2007-10／2008-03在上海市第六人民医院中心实验室完成。材料：2月龄新西兰纯种大耳白兔6只用于骨髓间充质干细胞取材与原代培养，1．073kg／L的Percoll分离液。方法：实验采用Percol分离液利用密度梯度离心法及结合贴壁分离筛选法来分离、纯化骨髓间充质干细胞，在采用密度梯度离心法得到骨髓间充质干细胞后，经贴壁培养及反复换液纯化骨髓间充质干细胞。分别取第3，5，7，9代骨髓间充质干细胞，行细胞计数，绘制细胞生长曲线。主要观察指标：倒置显微镜下观察原代及传代细胞的形态、生长情况。采用CD44及CD34抗体进行间接免疫荧光标记鉴定培养的干细胞。CD44染色呈阳性，CD34染色呈阴性，说明所提取、纯化的细胞是骨髓间充质干细胞。结果：增殖传代的骨髓间充质干细胞呈长梭形均匀分布生长，形态比原代培养的细胞更均匀，细胞生长旺盛、增殖迅速，胞核明显，核仁清晰，核浆比例大，细胞形态均匀，平行排列呈螺旋状或漩涡状，传代至第5代时无明显变化。随传代次数的增加，细胞增殖能力逐渐下降，第3～5代细胞增殖能力强。所分离培养的细胞均表达CD44，不表达CD34。结论：在体外采用密度梯度离心及贴壁培养法可获得高纯度的兔骨髓间充质干细胞。     

NF-1在瘢痕疙瘩中表达的研究

目的：通过比较人瘢痕疙瘩与正常皮肤组织中NF-1（nulear factor 1）在mRNA水平的表达量,来研究该基因在瘢痕疙瘩中发生的变化,并探讨其意义。方法：收集了3例正常皮肤标本和3例瘢痕疙瘩标本,用荧光定量PCR分别检测两种组织中NF-1在mRNA水平的表达量。结果：正常皮肤组和瘢痕疙瘩组中NF-1在mRNA水平的表达差异显著（P〈0．05）,正常皮肤组中NF-1的表达量是瘢痕疙瘩组的35倍。结论：NF-1 mRNA的高表达可能与瘢痕疙瘩疙瘩的发生相关,具体机制尚需进一步研究。     

诱导表皮干细胞向汗腺上皮细胞分化的研究

目的通过探索体外诱导表皮干细胞向汗腺上皮分化可能性,为汗腺组织工程探索新的种子细胞来源。方法分别收集正常皮肤表皮细胞．利用流式细胞仪多参数分选表皮干细胞;于不同时间点连续观察,不同浓度EGF（50～1000ng／mL）作用于表皮干细胞后的细胞生长动力学变化,免疫荧光鉴定汗腺细胞表型（NHE-1,NKCC-1）流式细胞仪分析不同浓度EGF对于细胞的毒性。结果50ng／mL和100ng／mL EGF对表皮细胞促增殖能力明显,且二者无显著差异（P〉0．05）：500ng／mL和1000ng／mL EGF抑制细胞增殖。1000ng／mL EGF对细胞增殖的抑制作用更明显（P〈0．05）。表皮干细胞经过50ng／mLEGF诱导后表达汗腺上皮相对特异性标记NHE-1及NKCC-1。结论表皮干细胞可成为汗腺组织工程种子细胞的重要来源。50ng／ml EGF可作为相对优化的表皮干细胞诱导条件。     

人角质形成细胞体外扩增与生物学特征变化

目的 研究人角质形成细胞体外扩增过程中生物学特征的变化,观察其角蛋白19(K19)mRNA表达及克隆形成率与扩增受限的关系。方法 取2-3岁健康儿童包皮20例,通过2.4 U/mL dispase和0.05％胰酶(tripsin)分离,获得角质形成细胞体外培养。细胞计数仪计数描绘生长曲线。光镜观察细胞体外扩增过程中形态学改变,同时计数克隆形成率。RT-PCR检测角质形成细胞K19和Involucrin的mRNA表达情况。结果 儿童包皮角质形成细胞体外平均最大扩增能力为(700±37)倍。细胞平均获得率为(1.64±0.297)×106/cm2包皮。角质形成细胞原代(P0)、第2代(P2)、第4代(P4)、第5代(P5)克隆形成率分别为:(45±4)％,(37±4)％,(28±3)％,(9±2)％,第6代(P6)克隆形成率消失。RT-PCR检测发现P0、P2、P4、P5有K19 mRNA表达,P6未见表达;Involucrin各代均可见表达。结论 人角质形成细胞体外扩增能力随传代逐渐降低,扩增受限与角质形成细胞中K19 mRNA表达及克隆形成率消失相关。     

PRP促进光老化人皮肤成纤维细胞胶原与透明质酸合成的研究

目的体外研究人皮肤成纤维细胞（HSFs）发生光老化时,富血小板血浆（PRP）对其合成胶原与透明质酸的影响。方法使用紫外线（UVA）照射体外培养的原代人皮肤成纤维细胞,并检测光老化细胞的细胞增殖情况及细胞倍增时间。用含不同浓度PRP（10%、30%、50%）的培养液培养光老化细胞,正常培养的光老化细胞为阴性对照,原代人皮肤成纤维细胞为阳性对照。ELISA检测各组细胞外液中胶原蛋白与透明质酸含量。结果经紫外线照射后,细胞增殖减弱,加入PRP后,伴随PRP浓度的增加,细胞倍增时间缩短;ELISA检测发现,经过UVA照射的成纤维细胞COL1、COL3及透明质酸合成量,显著低于正常培养的成纤维细胞（P〈0.01）。在PRP作用后,成纤维细胞的COL1、COL3及透明质酸合成量均明显增加（P〈0.01）。结论PRP能显著促进光老化人皮肤成纤维细胞胶原与透明质酸合成,可应用于皮肤抗衰老的研究。     

无血清培养不同年龄人表皮细胞(hECs)的扩增规律与原代表型的比较研究

目的无血清培养条件下,研究不同年龄人表皮细胞(human epidermal cells,hECs)的体外扩增规律,比较不同年龄hECs原代细胞表型.方法临床收集50例包皮环切术中丢弃的皮肤组织,包括中年组(A,35～52岁,11例)、青年组(Y,18～27岁,17例)、儿童组(C,2～12岁,22例).以Dispase和胰酶(tripsin)-EDTA分离,收集hECs并进行体外培养.每个年龄组随机选取5例,各代细胞计数,计算最大扩增倍数,并统计分析.收集原代细胞测量平均直径,记录克隆形成率,流式细胞仪(FACS)检测细胞K19阳性百分率.结果中年、青年、儿童组包皮来源的表皮细胞最大扩增倍数分别为(719±65)、(730±47)、(729±56)倍,各组间无统计学差异(P＞0.05).全体随机标本平均可扩增(728±53)倍,达到最大扩增量所需平均时间为(31±6)d.中年、青年、儿童组,表皮细胞平均直径分别为(3.44±0.42)μm,(3.54±0.46)μm,(3.55±0.37)μm,各组间无统计学差异(P＞0.05);克隆形成率分别为(36.5±5.3)%,(36.9±6.8)%,(36.4±5.1)%,各组间无统计学差异(P＞0.05);FACS检测中K19阳性细胞百分率分别为,(42.55±4.61)%,(42.47±6.58)%,(41.77±4.73)%,各组间无统计学差异(P＞0.05).结论无血清培养hECs的体外扩增规律与年龄因素无关,不同年龄hECs最大扩增能力取决于原代细胞表型.     

TBX22基因多态性与非综合征性唇腭裂相关关系的研究

目的：探讨TBX22基因多态性与中国华东地区部分人群非综合性征唇腭裂的关系。方法：选取80个核心家庭的80例NSCL/P患儿为实验组;选取80例正常儿童作为对照组。分别提取患儿及其父母和正常儿童的外周血DNA。应用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）分别扩增TBX22基因编码区外显子3的全部序列（包含G359A、A361G突变位点）,然后运用DNA测序技术,检测华东地区核心家庭的TBX22基因编码区的突变情况,分析记录基因型。根据测序所得基因型数据,比较患者组与正常儿童的基因型和等位基因频率,并对核心家庭的数据进行单倍型相对风险分析（haplotype relative risk,HRR）,对父母至少一方为杂合子的核心家庭进行传递不平衡检验（transmitted disequilibrium test,TDT）。结果：TBX22基因A361G未检出多态性;G359A检测出基因多态性,实验组和对照组儿童进行病例对照研究发现基因型频数分布差异有统计学意义（P〈0.05）。而两组间单体型相对风险率的分析（HRR）和传递不平衡检验（TDT）结果均无统计学意义（P〉0.05）。结论：TBX22基因G359A位点多态性与中国华东地区部分人群NSCL/P的发生相关,可能是NSCL/P的易感基因。     

连续褥式缝合技术在包皮环切术中的应用

目的:探讨连续褥式缝合技术在包皮环切术中应用的效果。方法:30例包皮过长或包茎患者,施行包皮环切术,切口采用连续褥式缝合技术进行缝合。结果:临床应用30例,随访3～6月,所有病例切口一期愈合,无出血、感染等并发症,外形美观,患者满意。结论:连续褥式缝合技术兼具间断缝合及连续缝合的优势,适宜在包皮环切术中应用。     

转染NF-1基因对人增生性瘢痕成纤维细胞胶原表达的影响

目的探讨重组NF1基因转染人增生性瘢痕成纤维细胞的可行性,以及转染NF1基因对细胞增殖速率和Ⅰ、Ⅲ型胶原合成的影响。方法体外重组NF1基因,借助真核表达载体系统,转入体外培养的人增生性瘢痕成纤维细胞,通过激光共聚焦显微镜观察报告基因表达,并确定细胞转染效率。应用Real time PCR法比较转染前后NF1 mRNA及Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA的表达;采用CCK-8比色法,比较转染细胞与未转染细胞增殖状况。结果基因转染后,约50%的被转染细胞表达绿色荧光;NF1 mRNA在转染组、转染空载体组、未转染组细胞中的表达分别为:7.27±1.16、2.01±0.38、1.87±0.29,转染组NF1 mRNA相对表达量较未转染组和转染空载体组明显增高(P<0.01,n=5);Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA在转染组、转染空载体组、未转染组细胞中的表达分别为:3.01±0.48和2.05±0.25、0.89±0.18和0.94±0.16、0.99±0.11和0.92±0.19;转染组Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA相对表达量较未转染组和转染空载体组均明显增高(P<0.01,n=5)。结论瘢痕成纤维细胞可作为NF1转染的靶细胞,NF1基因可能是导致...     

生长因子促皮肤创面愈合的研究进展

皮肤损伤是临床上常见的外伤之一,大面积皮肤缺损更会危及到病人生命.为了治疗皮肤损伤,人们一方面努力寻找修复替代物,在组织工程皮肤方面投入了大量研究[2];另一方面,人们又积极研究创伤修复过程中的参与因素.皮肤创伤愈合是一个包含各类细胞、蛋白质、蛋白酶以及生长因子等相互作用的复杂的过程.