人树突状细胞特异性细胞间黏附分子-3-结合非整合素基因RNAi

背景：慢病毒载体是一个能够在原代培养的人树突状细胞中进行RNA干扰的有效工具，但目前国内对RNA干扰技术应用于人树突状细胞特异性细胞间黏附分子-3-结合非整合素分子的研究却少有报道。 目的：拟构建人树突状细胞特异性细胞间黏附分子-3-结合非整合素基因RNA干扰慢病毒载体，为调控人树突状细胞特异性细胞间黏附分子-3-结合非整合素表达水平提供有利的工具。 方法：根据人树突状细胞特异性细胞间黏附分子-3-结合非整合素基因的mRNA序列选择4条靶序列，设计合成靶序列的Oligo DNA，退火形成双链DNA，与经Age Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切后的pGCSIL-GFP载体连接产生DC-SIGN慢病毒载体，采用PCR及测序鉴定，应用Western blot技术外源性筛选干扰效率高的有效靶序列。用慢病毒包装系统pGCSIL-GFP、pHelper 1.0和pHelper 2.0共转染包装293T细胞，包装产生慢病毒，以系列稀释法测定病毒滴度。 结果与结论：PCR扩增和测序结果显示，人树突状细胞特异性细胞间黏附分子-3-结合非整合素核苷酸链序列插入正确，外源性筛选确定两条干扰效率高的有效靶序列。利用筛选确定的有效靶序列，包装产生慢病毒，其浓缩病毒悬液的滴度为1× 109 TU/mL。证实实验成功构建了DC-SIGN基因慢病毒载体。 关键词：慢病毒载体；RNA干扰；DC-SIGN基因；树突状细胞；结核病     

σ-因子对结核分枝杆菌生理学及致病力的作用

MTB能在各种恶劣环境中生存并感染宿主,其强大的环境适应能力与自身复杂的基因表达调控系统密切相关.起始转录是原核生物表达调控中至关重要的一步,原核生物需要σ因子辨认转录起始点.     

噬菌体D29不同途径给入在小鼠体内的代谢分布

目的观察噬菌体D29通过不同途径给入后在小鼠体内的代谢情况,为噬菌体D29用于肺结核治疗寻找合适的给药途径。方法 96只BALB/c小鼠随机分为滴鼻组(n=48)、皮下注射组(n=24)、肌内注射组(n=24),按各组给药途径每只给予7.5×108 PFU噬菌体D29,分别于1、2、3、4 h(滴鼻组加测5、6、8、12 h)取6只小鼠眼球采血后断颈处死,测量噬菌体D29在血液、肺、肝、脾中的滴度。结果不同途径给入噬菌体D29后各个时间点测得的肺部滴度比较均有显著差异(P<0.05),滴鼻、皮下和肌内注射1 h时肺部D29的量分别为(5.7±3.2)×106 PFU、(1.9±1.4)×104 PFU和(1.7±1.1)×104 PFU,在肺部完全失活时间分别是12、3和4 h;皮下和肌内注射组1 h时测得在肝脏的滴度显著高于脾脏(均P<0.05),而滴鼻后在肝脏、脾脏各个时间点均未测出噬菌体D29。结论 3种给药途径比较,滴鼻到达肺部的噬菌体D29最多,维持时间更长,是治疗肺部结核合适的给药途径,但不是治疗肺外结核的理想给药途径。     

分枝杆菌病噬菌体33D基因组学特征及抗结核潜力

【摘要】 目的 研究分枝杆菌噬菌体33D的基因组特性并探索其抗结核治疗的潜力。方法 通过鸟枪法完成33D全基因组测序;使用 DNAStar、TRF、Promoter predictions、tRNAscan SE、Glimmer、BLAST 软件分别对33D基因组进行分析。结果 噬菌体33D基因组为线性双链DNA,全长50036bp;含有84个推定基因,17个已知功能的基因。其中噬菌体DNA复制相关基因：gene6、7、8、9和gene 14;裂解酶基因：gene 47和gene 48。结论 噬菌体33D为烈性噬菌体,具有抗结核潜力,未发现致病基因,可作为“鸡尾酒疗法”的候选噬菌体。     

分支杆菌噬菌体Leo生物学特性及抗结核作用

目的 明确分支杆菌噬菌体Leo的生物学特性及其抗结核作用,为“鸡尾酒疗法”筛选候选噬菌体。方法 采用双层平板法制备噬菌体Leo,观察噬菌斑形态;电镜观察噬菌体颗粒形态;提取噬菌体DNA,限制性内切酶酶切分析确定其核酸类型;以不同MOI扩增噬菌体Leo,确定最佳MOI及最低MOI;通过一步生长曲线,确定潜伏期及裂解量;采用终点滴定反浊法测定耻垢分支杆菌对噬菌体Leo的耐受突变率;检测噬菌体Leo对酒精、温度的耐受性及在不同pH下的裂解能力;通过体外杀结核分枝杆菌实验,明确噬菌体Leo对结核分枝杆菌的杀灭作用。结果 Leo噬菌斑圆形透明,边缘清晰,含对称的多面体头部,直径(70±3.0)nm, 可弯曲的尾部,尾长(211±31.7)nm;其基因组能被限制性内切酶HindⅢ、BglⅠ切开;最佳MOI为0.0 0001,最低MOI为0.0 001,潜伏期为150 min,裂解量74,耐受突变率为10^-7。Leo对温度、酒精敏感,在pH 7.4和pH 5.0时均能裂解宿主菌。Leo作用于结核分支杆菌72 h后,Leo组菌量明显低于空白组(P <0.05)。结论 分支杆菌噬菌体Leo属长尾噬菌体科,双链DNA噬菌体,能够杀灭结核分支杆菌,可作为“鸡尾酒疗法”的候选噬菌体。     

分枝杆菌噬菌体Chy2的分离及生物学特性

目的分离鉴定新分枝杆菌噬菌体并研究其生物学特性。方法以平板法从泥土中分离纯化噬菌体,紫外线诱导法鉴定溶原性,从噬菌斑大小、颗粒形态和限制性内切酶分析三方面比较Chy2、D29、TM4异同;以不同感染复数(MOI)扩增Chy2,测定最佳MOI;通过一步生长实验测出Chy2潜伏期、裂解期和裂解量;采用单斑法测定MOI的裂解谱;检测MOI在不同pH值培养基中裂解耻垢分枝杆菌mc2155的能力。结果成功分离纯化1株分枝杆菌噬菌体,命名为Chy2,其噬菌斑圆形透明,紫外线诱导法处理宿主菌后不能形成噬菌斑,头部呈椭圆形,长尾,基因组核酸能被双链DNA内切酶EcoRⅠ、HindⅢ、BamHⅠ及XbaⅠ切开,大小约49 kb,与D29、TM4差异大;Chy2最佳MOI为9.58×10-5;Chy2一步生长周期为270 min,潜伏期210 min,裂解期60 min,裂解量为23;Chy2能裂解耻垢分枝杆菌mc2155、结核菌标准株H37Rv、多数临床耐药株;在7H9固体培养基pH值为5.0和7.4时,Chy2均能裂解耻垢分枝杆菌mc2155。结论 Chy2属长尾噬菌体科,基因组为双链DNA,宽噬谱广,是一种潜在的抗结核药物资源。     

RNA 干扰 DC-SIGN 表达对树突状细胞成熟及功能的影响

目的 研究慢病毒介导RNA干扰树突状细胞特异性细胞间黏附分子-3结合非整合素因子(DC-specific ICAM-3 grabbing nonintegrin,DC-SIGN)分子表达及干扰后对树突状细胞(dendritic cells,DCs)成熟度及功能的影响. 方法 分离健康人外周血单核细胞,用GM-CSF和IL-4刺激诱导DCs.培养第4天分3组:RNA干扰组、阴性对照组和空白对照组,按实验设计加入病毒共孵育12 h后换液,继续培养60 h后用荧光显微镜观察转染效率及荧光强度,培养第6天加LPS刺激成熟.第7天收集细胞用RT-PCR检测DC-SIGN mRNA水平,Western blot检测DCs总DC-SIGN蛋白表达水平,流式细胞仪检测DCs表面DC-SIGN水平,ELISA检测DCs培养上清液中IL-12、IL-10水平,混合淋巴细胞反应检测DCs对CD4+ T淋巴细胞刺激增殖能力的影响. 结果①荧光显微镜显示感染复数(MOI)为20时,DCs感染病毒的效率达85%.②RT-PCR证实RNA干扰后DC-SIGN mRNA表达水平(0.252 5±0.139 6)显著低于另2组(0.572 2±0.190 9、0.548 7±0.119 3),差异有统计学意义(F=8.142,P<0.05).③Western blot检测干扰组DCs内总DC-SIGN 水平(0.323 7±0.057 0)显著低于另2组(0.590±0.014、0.578 ±0.023),差异有统计学意义(F=51.376,P<0.05).④流式细胞仪检测干扰组DCs表面表达DC-SIGN水平[(43.10±10.12)%]显著低于另2组[(73.05±8.11)%、(74.49±5.56)%],差异有统计学意义(F=14.19,P<0.05).⑤各组间成熟标志物HLA-DR及CD86差异无统计学意义(P>0.05).⑥ELISA结果显示各组DCs培养上清液中IL-10、IL-12水平差异无统计学意义(P>0.05).⑦混合淋巴细胞反应结果显示各组DCs诱导CD4+T淋巴细胞增殖能力差异无统计学意义(P>0.05). 结论 慢病毒介导的RNA干扰能有效抑制DCs表面DC-SIGN分子表达,抑制DC-SIGN表达对DCs成熟度及DCs功能无影响.     

人树突状细胞特异性细胞间黏附分子-3-结合非整合素基因RNAi慢病毒载体的构建及外源性筛选与鉴定

背景:慢病毒载体是一个能够在原代培养的人树突状细胞中进行RNA干扰的有效工具,但目前国内对RNA干扰技术应用于人树突状细胞特异性细胞间黏附分子-3-结合非整合素分子的研究却少有报道.目的:拟构建人树突状细胞特异性细胞间黏附分子-3-结合非整合素基因RNA干扰慢病毒载体,为调控人树突状细胞特异性细胞间黏附分子-3-结合非整合素表达水平提供有利的工具.方法:根据人树突状细胞特异性细胞问黏附分子3结合非整合素基因的mRNA序列选择4条靶序列,设计合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经Age I和EeoR I双酶切后的pGCSIL-GFP载体连接产生DC-SIGN慢病毒载体,采用PCR及测序鉴定,应用Westem blot技术外源性筛选干扰效率高的有效靶序列.用慢病毒包装系统pGCSIL-GFP、pHelper 1.0和pHelper 2.0共转染包装293T细胞,包装产生慢病毒,以系列稀释法测定病毒滴度.结果与结论:PCR扩增和测序结果显示,人树突状细胞特异性细胞间黏附分子-3-结合非整合素核苷酸链序列插入正确,外源性筛选确定两条干扰效率高的有效靶序列.利用筛选确定的有效靶序列,包装产生慢病毒,其浓缩病毒悬液的滴度为1×109TU/mL.证实实验成功构建了DC-SIGN基因慢病毒载体.     

循证护理模式对慢性阻塞性肺疾病患者治疗效果

目的 探究循证护理模式对慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease,COPD）患者治疗依从性和肺功能的影响及其对COPD急性加重（acute exacerbation of COPD,AECOPD）的预防价值。
方法 选择2016年1月至2017年5月收治的COPD患者86例,随机分为循证组和对照组,各43例,在常规治疗的基础上,对照组采用常规护理模式,循证组采用循证护理模式各护理6个月,院外随访12个月。比较两组护理前后各项疗效指标。
结果 与护理前相比,两组的FEV₁%、FEV₁/FVC、COPD评估测试（COPD assessment test,CAT）评分和6 min步行试验（6 minute walk test,6 MWT）距离等指标均有改善（P < 0.05）;循证组的FEV₁%、FEV₁/FVC和6 MWT距离高于对照组,CAT评分低于对照组,差异有统计学意义（P < 0.05）。护理后,两组患者焦虑自评量表（self-rating anxiety scale,SAS）和抑郁自评量表（self-rating depression scale,SDS）评分降低,服药依从性自我效能量表（medication adherence self-efficacy scale,MASES）和生命质量测定量表（EORTC QLQC30）评分升高,差异均有统计学意义（P < 0.05）;循证组SAS和SDS评分低于对照组,MASES和QLQ-C30评分高于对照组,差异有统计学意义（P < 0.05）。对照组和循证组在出院后12个月内的AECOPD发生率分别为67.44%（29/43）和46.51%（20/43）,经log-rank检验,循证组发生AECOPD风险的低于对照组（P < 0.05）。对照组和循证组在出院后12个月内分别有2例和1例死亡病例。
结论 循证护理模式可以有效改善COPD患者的症状和焦虑抑郁状态,提高肺功能和治疗依从性,降低AECOPD发生风险。