利用CRISPR/Csa9技术构建溶酶体运输调节因子基因缺陷C57BL/6小鼠

目的获得自然杀伤(NK)细胞缺陷的小鼠动物模型,并研究溶酶体运输调节因子(Lyst)基因的功能。方法采用CRISPR/Cas9技术敲除C57BL/6小鼠的Lyst基因:针对小鼠Lyst基因编码区第50个外显子,设计CRISPR/Cas9靶点引物(sgRNA),并重组构建pUC57-Lyst-sg RNA载体。将重组质粒体与Cas9质粒分别利用T7 RNA聚合酶体外转录为mRNA,并按比例显微注射入小鼠受精卵,将受精卵移植到受体动物。获得子代小鼠后,利用PCR扩增和测序方法筛选Lyst基因发生改变的动物个体。结果显微注射移植后获得7只F0代基因敲除小鼠,且毛色均发生了明显的变化。结论利用CRISPR/Cas9技术可以构建Lyst基因缺陷小鼠,外观表型与已有的文献报道一致。     

布氏锥虫葡糖基磷脂酰肌醇(GPI)的研究进展

布氏锥虫 (Trypanosomabrucei)是一种原虫性寄生虫 ,通过采采蝇 (tsetsefly)的传播感染人和其它哺乳动物 ,导致人的昏睡病和家畜的那卡那病。布氏锥虫有两个截然不同的生活阶段 ,即血液期 (bloodstreamstage ,寄生于哺乳动物血细胞内 )和昆虫期 (insectstage ,又叫循环期或感染期 ,寄生于采采蝇的中肠内 )。这种单细胞寄生虫的两个生活阶段 ,其体表覆盖大量的GPI锚定蛋白 (McConvilleetal.,1 993;Paysetal.,1 998)、脂磷酸聚糖及糖基肌醇磷脂 (GIPLs)等多种成分 (McConvilleandFerguson ,1 993;Ferguson,1 999;IlgoutzandMcConville…     

旋毛虫编码新生幼虫p46 kDa抗原基因重组融合蛋白对小鼠的免疫保护性研究

目的 探讨旋毛虫编码新生幼虫p46 kDa抗原基因重组融合蛋白WN10对小鼠的免疫保护性。方法 将纯化的重组融合蛋白WN10以20μg/只的剂量分3次免疫小鼠后，攻击感染旋毛虫肌幼虫200条／只，检查旋毛虫7日龄成虫数、雌虫体外产生新生幼虫数、感染35d的肌幼虫数并计算减虫率，同时用ELISA法检测血清中抗WN10抗体IgG滴度。结果WN10免疫小鼠后获得旋毛虫7日龄成虫、肌幼虫的减虫率分别为64．28％和61．21％，均与感染对照组和佐剂对照组差异显著；获得雌虫产新生幼虫的减虫率为16．46％，与感染对照组和佐剂对照组差异不显著；WN10免疫组小鼠在第3次免疫后1周可检测到高滴度的抗WN10抗体IgG，在攻击感染旋毛虫9周后仍维持在较高水平。结论 编码旋毛虫新生幼虫p46 kDa抗原基因重组融合蛋白可诱导小鼠产生较强的抗旋毛虫保护性免疫。     

嗜肠型小鼠肝炎病毒RT-PCR诊断方法的建立及其应用

目的建立小鼠肝炎病毒(MHV)RT-PCR检测方法,为小鼠的日常生产提供一种快速的监测手段。方法提取小鼠结肠组织的总RNA,通过反转录反应合成第一链c DNA,以其为模板,利用MHV的4对特异性引物,进行PCR扩增。对PCR反应条件(包括引物、引物浓度、退火温度、模版浓度等)进行优化。对PCR扩增出的基因片段进行克隆测序,进一步确定扩增结果的特异性。结果其中2对MHV引物具有良好的扩增性和特异性,利用这两对引物进行的PCR检测结果与ELISA检测结果相符。结论 MHV的RT-PCR检测方法具有良好的特异性,并且操作相对简单,可以作为小鼠生产过程中肝炎病毒发生的一种快速的监控(测)方法。     

棉籽壳菌糠饲喂卡拉库尔羊效果研究

分析了棉籽壳菌糠饲喂卡拉库尔羊的效果。结果表明 ,用菌糠取代 6 0 %的棉籽壳与取代 4 5 %的棉籽壳和全部用棉籽壳 ,卡拉库尔羊平均日增重差异不显著 (P >0 .0 5 ) ,而饲料成本比对照组降低 0 .11元 /kg ,经济效益显著     

旋毛虫新生幼虫p46000抗原基因的表达与抗原性分析

目的　对旋毛虫新生幼虫p46000抗原基因进行原核表达并检测重组抗原的抗原性。　方法　利用聚合酶链反应 (PCR)扩增目的基因 ,克隆到原核表达载体 pET-28a ,构建重组表达质粒 ,经酶切及测序鉴定后转化大肠埃希菌BL21(DE3 ),以异丙基-β-D 硫代半乳糖苷诱导表达。十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)、酶联免疫吸附测定 (ELISA)和蛋白质印迹法 (Western blotting)分析表达产物。　结果　 SDS-PAGE结果显示表达产物的分子量约为Mr 48000 ,与理论值相符。ELISA和Western blotting结果表明 ,重组蛋白可被旋毛虫感染的猪血清和兔抗重组蛋白血清识别 ;兔抗重组蛋白血清可识别旋毛虫新生幼虫抗原Mr 46000蛋白。　结论　成功表达了旋毛虫新生幼虫p46000抗原基因 ,重组抗原具有良好的抗原性。     

旋毛虫肌幼虫p43cDNA的克隆及鉴定

目的 克隆旋毛虫肌幼虫p43cDNA并对其表达的融合蛋白酶活性进行鉴定与分析。 方法 用PCR技术从旋毛虫肌幼虫cDNA文库中扩增靶基因，克隆到pMD?鄄18T载体，转化至大肠埃希菌NovaBlue，序列测定后克隆到原核表达载体pET28a并转入表达菌DE3中。经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达后提取包涵体并复性，通过降解双链λDNA测定其融合蛋白脱氧核糖核酸酶II（DNase II）活性。 结果 成功克隆到p43 cDNA序列，该cDNA序列与美国发表的存在两个核苷酸的变异，分别为第210位的C变为T，第604位的A变为G。基于3名研究者从旋毛虫T. spiralis美国分离株获得的序列相同、6名国内研究者（含本课题组）从T. spiralis中国分离株获得的序列也相同，由此可以确定这两个核苷酸的变异为T. spiralis中国分离株特异性和特征性单核苷酸多态性（SNP）标记。p43重组蛋白能够降解双链λDNA，表明其有DNase II酶活性。 结论 成功克隆到p43cDNA，T. spiralis中国分离株的p43cDNA具有两个SNP标记，其表达的重组蛋白具有DNase II酶活性。     

旋毛虫新生幼虫cDNA文库的免疫筛选

目的　获取具有抗原性的旋毛虫新生幼虫基因。　方法　以旋毛虫感染猪血清为抗体探针,对旋毛虫新生幼虫cDNA文库进行免疫筛选,将获得的阳性克隆进行测序及分析。结果　从45×105旋毛虫新生幼虫cDNA文库重组子中共获得158个阳性克隆。序列分析结果表明,其中有36个新的cDNA序列,已报道的序列有5个,有12个序列无开放阅读框架(ORF),与旋毛虫线粒体基因组DNA同源。　结论　获得具有抗原性的旋毛虫抗原编码cDNA分子