检测DENV-2活病毒含量RTCA标准曲线法的建立

目的利用实时无标记细胞分析系统(real-time cellular analysis,RTCA)建立半数细胞指数时间(CIT50)与病毒滴度(TCID50)相关性的标准曲线,评估RTCA技术在监测2型登革病毒(DENV-2)感染BHK细胞后引发细胞病变效应(CPE)中的可行性和应用价值。方法检测不同培养条件下BHK细胞的CI值变化,筛选合适的初始细胞接种密度及血清浓度;应用RTCA分析已知不同TCID50滴度DENV-2感染BHK细胞的CIT50值,构建CIT50-TCID50标准曲线,计算回归方程;收集DENV-2感染C6/36细胞后第1~4d的培养上清(D1,D2,D3,D4),利用RTCA法和TCID50法分别检测上清中DENV-2滴度,分析CIT50-TCID50标准曲线法的灵敏度和可行性。结果 BHK细胞以初始接种密度为2×104个/孔,血清浓度为2%的培养条件为最佳;不同滴度DENV-2感染后BHK细胞的生长曲线均左移,CIT50与TCID50间呈线性负相关,线性方程为y=-7.007x+75.546(R2=0.9854);不同时间感染C6/36细胞培养上清中病毒含量(logTCID50/mL):RTCA标准曲线法为4.90±0.05(D2)、6.18±0.20(D3)、6.04±0.10(D4);传统TCID50法为0(D1)、6.25±0.49(D3)、5.87±0.35(D4)。结论利用RTCA技术建立的CIT50-TCID50标准曲线法,可用于已知DENV-2在BHK细胞的定量检测,结果较TCID50法更客观,且该法操作便捷且灵敏度高,为评估DENV-2感染性活病毒颗粒的毒力提供了新的技术手段。     

埃及伊蚊黄蛋白c基因的克隆、表达及其体外抗凝血作用

目的 克隆表达埃及伊蚊黄蛋白c (Aael-yellow-c)基因，并探讨r Aael-yellow-c蛋白体外抗凝血作用。方法 RT-PCR扩增Aael-yellow-c成熟肽基因，纯化后的片段与pEASY-E1载体连接，转化至大肠埃希菌DH5α感受态细胞，取菌液进行PCR、双酶切和测序鉴定。0.1 mol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导蛋白表达后，镍柱亲和层析纯化重组蛋白，采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白质免疫印迹（Western blotting）分析重组蛋白表达情况。比浊法观察不同浓度r Aael-yellow-c蛋白对二磷酸腺苷诱导的血小板聚集活性影响。手工法检测不同浓度r Aael-yellow-c蛋白对人血浆凝血酶原时间（PT）、部分凝血活酶时间（APTT）及凝血酶时间（TT）的影响。采用SPSS 18.0统计软件进行统计学分析，组间差异比较采用t检验。结果Aael-yellow-c基因CDS区为1 287 bp，含27个氨基酸组成的信号肽，成熟肽序列长1 200 bp，编码399个氨基酸。RT-PCR扩增获得Aael-yellow-c...     

两株登革2型病毒感染BALB/C小鼠特异性抗体产生动态的比较

目的：两株登革2型病毒(Dengue Type 2 virus，DV2)初次和再次感染BALB／C小鼠建立动物感染模型，对其产生特异性抗体进行动态观察，探讨感染DV2NGG株和DV2临床分离株(B株)引起的体液免疫应答的差异。方法：两株Dv2毒株摸拟自然感染途径，经皮下多点注射建立BALB／C小鼠感染动物模型；采用间接ELISA法检测感染动物血浆中抗DV2特异性IgM类抗体、IgC类抗体，并同时分离病毒观察病毒血症期的变化。结果：不同DV2毒株初次、再次感染BALB／C小鼠后诱导特异性Ig产生的类别存在差异，且DV2B株再次感染动物后表现为病毒血症期相对延长。结论：两株DV2诱导性抗体产生的动态与病毒血症期不同。     

结核分枝杆菌RelE毒素蛋白对肺癌A-549细胞成瘤性的抑制作用

目的探索结核分枝杆菌RelE毒素蛋白对动物体内的肺癌A-549细胞的成瘤性的影响,以及因此产生的对动物免疫功能的作用。方法构建BALB/C小鼠的免疫抑制模型,通过接种稳定表达结核分枝杆菌RelE毒素蛋白、RelB抗毒素蛋白和RelBE毒素-抗毒素蛋白的肺癌A-549细胞株,含空质粒PcDNA3.1（＋）的A-549细胞株,以及正常的肺癌A-549细胞,构建BALB/C小鼠荷瘤模型,观察各组小鼠的肿瘤生长情况,并测定各组小鼠的脾淋巴细胞增殖活性以及血清IFN-γ和IL-2的浓度。结果接种了表达RelE毒素蛋白的A-549细胞的小鼠组,肿瘤生长较其它实验组慢,肿瘤结节的瘤体体积和数量都较其它实验组有明显差异（P〈0.05）。对各组小鼠免疫功能变化的研究发现,各实验组小鼠的脾淋巴细胞增殖活性以及血清IFN-γ和IL-2的浓度的差异没有统计学意义（P〉0.05）。结论结核分枝杆菌RelE毒素蛋白对肺癌A-549细胞的成瘤性有抑制作用。     

结核分枝杆菌RelE毒素蛋白对肺癌A-549细胞的生长抑制作用

目的探索结核分枝杆菌RelE毒素蛋白是否对肺癌A-549细胞有生长抑制作用。方法采用PCR技术克隆结核分枝杆菌RelE、RelB、RelBE基因,分别构建真核质粒PcDNA3.1-RelE、PcDNA3.1-RelB和PcDNA3.1-RelBE。经酶切分析和DNA测序证实重组质粒构建成功后,采用脂质体转染方法分别转入肺癌A-549细胞,经RT-PCR鉴定后,建立稳定表达相关蛋白的细胞株。通过细胞生长曲线、活细胞蛋白含量测定、MTT细胞增殖实验、HE染色观察细胞凋亡、流式细胞术检测瞬时转染细胞的凋亡率等,观察结核分枝杆菌RelE毒素蛋白是否对肺癌A-549细胞具有生长抑制和促凋亡的作用。结果结核分枝杆菌RelE毒素蛋白组的肺癌A-549细胞增殖速度低于其他各组,对营养缺乏更为敏感,相同范围视野下凋亡细胞多于其他各组,瞬时转染细胞的凋亡率也高于其他组(P<0.05)。结论结核分枝杆菌RelE毒素蛋白对肺癌A-549细胞具有生长抑制和促凋亡的作用。     

两株登革2型病毒感染BALB/c小鼠后发病情况的观察

登革病毒 (denguevirus ,DEN)属于虫媒病毒 ,其致病机制一直是研究的热点 ,更多的学者注意到登革出血热 登革休克综合征 (denguehemorrhagicfe ver dengueshocksyndrome ,DHF DSS)可能是由病毒毒力变异 ,不同毒株感染的流行所致〔1〕。目前 ,许多相关研究多通过体外试验完成 ,难以准确反映体内情况。本研究采用DEN2NGC株和从患DHF的病人血清中分离得到的一株DEN2 〔2〕,经腹部皮下多点注射分别感染BALB c小鼠 ,观察登革 2型病毒不同毒株感染BALB c小鼠后的发病情况 ,为探索DEN感染的致病机制提供线索。材料和方法毒株与细胞 :…     

登革病毒致病相关因素与体液免疫机制研究进展

登革病毒(Dengue virus,DEN)属黄病毒科、黄病毒属的一个血清学亚群,包括四个不同血清型(DEN1～DEN4)。是能引起人类发生从自限性的类似流感样综合征的登革热(dengue fever,DF)到严重威胁生命的登革出血热(Dengue hemorrhagic fever,DHF)及登革休克综合征(Dengue shock syndrome,DSS)的病原体。近年来登革病毒感染在     

DV2 NGC株感染BALB/C小鼠后IL-4、IFN-γ产生动态的研究

目的 :观察 2型登革病毒NGC株感染BALB/C小鼠后其IL 4、IFN γ产生动态 ,研究登革病毒感染的免疫机制。方法 :用不同含量的DV2NGC株经皮下多点注射 ,间接ELISA法测定感染后不同时间各组小鼠血浆IL 4、IFN γ含量。结果 :DV2NGC株感染小鼠产生IL 4和IFN γ动态不同。初次感染早期 ,IL 4水平明显升高 ,而IFN γ处于较低水平 ;再次感染后第 1天 ,IL 4水平达最高峰 (4 2 94 6 6 8± 349 0 38) pg/ml,IFN γ则于第 4天和第 1 1天达较高水平 ,两者的产生彼消此长 ,且产生动态与感染病毒量有关。结论 :DV2NGC株感染早期 ,体…     

免疫学教学中应用创新教学模式的实践探索

目的为提高免疫学课程的教学质量,加深学生对课程的理解,研究创新教学模式在免疫学教学中的应用效果。方法2019年2—6月,选取该校2017级临床专业学生227名,分别为1班115名,2班112名开展该次创新教学模式研究。1班学生进行创新教学模式上课,包括以问题为导向的(PBL)翻转教学模式、渗透愉悦教学模式以及科研促进教学模式等,2班学生进行以授课为导向(LBL)的传统教学模式。对比不同教学模式后两组学生的期末成绩、对课程的满意度、学习动力评分、记忆学习态度评分。结果1班学生期末成绩(83.78±5.36)分,2班学生期末成绩(78.69±5.23)分,1班学生期末成绩得分显著高于2班学生,差异有统计学意义(P<0.05);1班学生课程满意度、学习动力评分显著高于2班学生,差异有统计学意义(P<0.05);学习态度评分中,1班学生在课堂表现、作业完成度、课外自学三项评分均显著高于2班学生,差异有统计学意义(P<0.05)。结论在免疫学教学中,使用创新教学法可提高学生学习成绩,增加学生的学习动力,提高学习态度评分,使学生掌握免疫学基本理论及发展规律,创新教学模式在免疫学教学中应用效果较佳。     

结核杆菌Rv0901基因真核表达质粒的构建及在细胞内的表达与鉴定

目的构建结核杆菌Rv0901基因的真核表达质粒并进行表达,为研究Rv0901基因的功能提供材料。方法以结核杆菌基因组DNA为模板PCR扩增Rv0901基因序列,将Rv0901基因定向克隆到真核表达质粒pcDNA3.1（＋）获得重组表达质粒,体外转染Cos7细胞,RT-PCR检测转染的情况,并提取转染细胞总蛋白和收集细胞培养液上清检测蛋白的表达,Western-blotting检测蛋白表达的特异性。结果成功扩增出Rv0901基因序列,成功构建重组真核表达质粒pcDNA3.1-Rv0901,重组质粒转染细胞后的RT-PCR能扩增出Rv0901基因序列,转染细胞总蛋白和细胞培养液上清均能特异表达Rv0901基因蛋白。结论成功构建Rv0901基因真核表达质粒并在真核细胞内进行了良好表达,为研究该基因功能打下了坚实基础。