结核分枝杆菌Rv2941蛋白抗原表位集中区免疫原性研究

目的 分析结核分枝杆菌Rv2941抗原的T细胞表位集中区的免疫原性,探究其作为结核病疫苗候选抗原的潜力。方法 通过免疫表位数据库(Immune Epitope Database,IEDB)分析Rv2941抗原的T细胞表位区(命名为Rv2941p)并构建表达载体PET32a-Rv2941p,诱导表达并纯化Rv2941p。将其与免疫佐剂二甲基三十六烷基铵(DDA)和PolyI:C乳化后,皮下免疫BALB/c小鼠3次,每次免疫间隔10 d,末次免疫1周后处死小鼠,进行免疫效果评价。采用ELISA法检测免疫后小鼠血清中IgG、IgG1和IgG2a抗体滴度以及免疫后小鼠脾脏淋巴细胞分泌IL-4、IL-2、IL-6和IFN-γ的水平。同时,利用流式细胞技术检测淋巴细胞内CD4⁺T、CD8⁺T细胞增殖情况以及胞内细胞因子(IFN-γ、TNF-α和IL-4)表达水平。结果 Rv2941p可溶性表达,并获得高纯度的蛋白。Rv2941p诱导产生了高水平的特异性抗体IgG,与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.001)。另外,Rv2941p提高了IgG2a/IgG1的比值。细胞因子检测结果显示,Rv2941p提高了IFN-γ和IL-6的分泌,与Ag85B组比较,差异有统计学意义(P<0.001)。同时,Rv2941p可以促进CD4⁺和CD8⁺T细胞的增殖分化,以及提高胞内IFN-γ和TNF-α的表达。结论 Rv2941p可以刺激小鼠产生较高的体液和细胞免疫,尤其Th-1类细胞免疫,可以作为结核病疫苗候选抗原,为结核病新型疫苗的开发奠定了基础。     

鸟-胞内分枝杆菌复合群鸟和胞内分枝杆菌亚种对20种药物的敏感性特征及亚种间药物敏感性比较

目的 分析鸟-胞内分枝杆菌复合群鸟分枝杆菌亚种和胞内分枝杆菌亚种对20种药物的敏感性特征及比较2个亚种间的药物敏感性差异。方法 用微孔板Alamar blue显色法分别检测97株鸟分枝杆菌和172株胞内分枝杆菌对克拉霉素、卷曲霉素和利福布丁等20种药物的最小抑菌浓度,判断其敏感性,分析2个亚种菌株对20种药物的敏感性特征以及对利福霉素类、氨基糖苷类和大环内酯类内药物的交叉耐药性,并比较2个亚种对20种药物的敏感性差异。结果 对鸟分枝杆菌敏感率高于80%的药物依次是卷曲霉素(100%,97/97)、阿米卡星(97.9%,95/97)、利福布丁(96.9%,94/97)、利福平和卡那霉素(83.5%,81/97)及克拉霉素(82.5%,80/97);对胞内分枝杆菌敏感率高于80%的药物依次是阿米卡星(99.4%,171/172)、卡那霉素(95.9%,165/172)、利福布丁(95.4%,164/172)、克拉霉素(94.2%,162/172)、氯法齐明(87.2%,150/172)、卷曲霉素和罗红霉素(86.1%,148/172)及利福喷丁(82.6%,142/172)。97株鸟分枝杆菌分别有1株、1株和17株而172株胞内分枝杆菌中分别有0株、7株和6株同时对氨基糖苷类、利福霉素类和大环内酯类内各种药物同时耐药或中度敏感。鸟分枝杆菌对利福平和卷曲霉素的敏感率明显高于胞内分枝杆菌。胞内分枝杆菌对利福喷丁、妥布霉素、卡那霉素、乙胺丁醇、莫西沙星、克拉霉素、阿奇霉素和罗红霉素的敏感率均高于鸟分枝杆菌。结论 鸟和胞内分枝杆菌均对卷曲霉素、阿米卡星、利福布丁和克拉霉素敏感性较高,对胞内分枝杆菌敏感的药物多于鸟分枝杆菌,利福喷丁仅对胞内分枝杆菌抗菌性较好,而利福平仅对鸟分枝杆菌抗菌性较好,乙胺丁醇对两个亚种敏感性均较差;对同一种类的药物做药物敏感性试验可为临床医生治疗鸟或胞内分枝杆菌感染选择合适的替代药物做依据。     

耐多药结核分枝杆菌中embB基因突变与乙胺丁醇耐药的相关性研究

目的 研究耐多药结核分枝菌中embB基因突变与乙胺丁醇耐药的相关性. 方法 比例法检测84株耐多药结核分枝杆菌的乙胺丁醇(EMB)耐药性,基因测序检测embB基因的突变,2检验分析二者之间的相关性. 结果 84株耐多药结核分枝杆菌中有43株(51.2%)对EMB耐药,41株(48.8%)对EMB敏感,57株耐多药菌株(67.9%)的embB基因发生突变.在43株EMB耐药菌株中,embB基因突变的菌株为40株(93.0%),而41株EMB敏感菌株中,embB基因突变的菌株为17株(41.5%),embB基因在耐药菌株中的突变频率远高于敏感菌株(2=25.58,P=0.00).embB306是最常见的突变位点,其在耐药菌株的突变率也高于敏感菌株(2=12.37,P=0.00),embB基因和embB306位点检测EMB耐药的敏感度、特异度和准确性分别为93.0%和65.1%,58.5%和73.2%,76.2%和69.0%. 结论 EMB耐药的产生与embB基因和embB306突变有关,二者用于检测EMB耐药有一定的参考意义.     

自贡市非结核分枝杆菌临床分离株的菌种鉴定结果分析

目的 对自贡市35株疑似非结核分枝杆菌（NTM）临床分离株进行菌种鉴定。方法 从自贡市各区（县）及市结核病防治获得的临床分枝杆菌分离株,通过罗氏培养基（L-J）、对硝基苯甲酸（PNB）和噻吩-2-羧酸肼（TCH）鉴别培养基初步鉴定为NTM,再经多位点PCR方法确定为NTM后,对rpoB、hsp64及its基因进行测序及分析鉴定。结果 35株疑似NTM临床分离株,通过初步鉴别,多位点PCR,rpoB、hsp64及its基因测序及分析鉴别出32株NTM,分别为脓肿分枝杆菌（M. abscessus）11株、胞内分枝杆菌（M. intracellulare）7株、堪萨斯分枝杆菌（M. kansasii）5株、鸟分枝杆菌（M. avium）3株、脓毒分枝杆菌（M. septicum）1株、马赛分枝杆菌（M. masseillense）1株、戈登分枝杆菌（M. gordonae）2株、副瘰疬分枝杆菌（M. parascrofulaceum）1株和Mycobacterium peregrinum 1株。结论 抗酸染色阳性、PNB/TCH鉴定为NTM的临床分离株中包含不同种类的NTM,自贡市NTM肺病的病原种类较多,以快生长脓肿分枝杆菌为主,其次为慢生长不产色菌的胞内分枝杆菌和缓慢生长光产色菌的堪萨斯分枝杆菌。实验室应开展进一步菌种鉴定,以指导临床正确诊断和合理治疗。     

结核分枝杆菌抗原Rv0585c人T细胞抗原表位鉴定及其免疫原性评价

目的 研究结核分枝杆菌抗原Rv0585c的抗原表位及其免疫原性,为结核病特异免疫诊断技术和疫苗的研发提供基础。方法 利用生物信息学TE-predict和IEDB人T细胞抗原表位预测软件进行结核分枝杆菌抗原Rv0585c的人T细胞抗原表位预测,根据预测结果,合成表位多肽,用ELISpot试验检测预测表位在临床结核病患者中的免疫反应性。分别采用高、低剂量（100 μg/只和50 μg/只）的Rv0585c抗原表位多肽、同时以高、低剂量（50 μg/只和20 μg/只）的Ag85B蛋白抗原为对照,对随机分组的BALB/c小鼠进行免疫。利用ELISA方法检测IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10的水平。结果 经生物信息学技术预测到Rv0585c 66个人T细胞抗原表位,选取合成了表位分布集中的抗原表位多肽9条。人群ELISpot试验筛选出3条阳性人T细胞表位多肽：P10110、P10112、P10117,用于肺结核检测的灵敏度分别为14.00%、12.00%和6.00%,特异度分别为100.00%、100.00%和97.96%;联合用于肺结核检测的灵敏度和特异度分别为22.00%和97.96%。动物免疫试验结果显示,P10110多肽高、低剂量刺激小鼠产生较高水平的IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10,P10112多肽高、低剂量刺激小鼠产生较高水平的IFN-γ、IL-2和IL-10,均高于阴性对照组,差异有统计学意义（P<0.001）。结论 Rv0585c蛋白及其T细胞表位具有较好的免疫原性及免疫反应性,能刺激机体产生较强烈的细胞免疫应答,具有潜在的结核病细胞免疫诊断和新型结核疫苗的应用价值。     

结核分枝杆菌体外药敏试验标准株的建立与评价

目的 按照《病原微生物菌(毒)种国家标准株评价技术标准》(WS/T 812—2022),对已有多年使用基础的5株中国临床来源结核分枝杆菌菌株进行系统鉴定评价,以此建立我国的结核分枝杆菌体外药敏试验标准株。方法 建立标准的实验操作程序,对菌株进行培养特性、表型、生化特征、药敏试验及分子特征检测等系统评价,完成全基因组测序,建立主代及工作菌株库。结果 菌株的表型、生化及分子生物学检测结果表明5株菌符合结核分枝杆菌特征,性状稳定;耐药类型为2株全敏感菌株,2株耐多药结核菌株和1株广泛耐药结核菌株;完成全基因组测序;已获得中国疾病预防控制中心病原微生物菌(毒)种保藏中心(CHPC)保藏编号。结论 5个菌株符合结核分枝杆菌体外药敏试验质控菌株及抗结核药物筛选及评价测试菌株的要求,将为中国标准株的建立工作提供参考,为我国结核病耐药监测以及抗结核药物研发提供有力的支撑。     

VNTR在陕西省耐药结核分枝杆菌基因分型中的研究

目的了解陕西省89例耐药结核分枝杆菌多位点数目可变串联重复序列分析(VNTR)的基因多态性及近期传播情况。方法选取陕西省10个地市结核分枝杆菌耐药菌株89株,提取基因组DNA,采用聚合酶反应(PCR)对15个VNTR位点进行检测分析,基因分型聚类分析采用Bio-Numerics5.0软件。结果经基因聚类分析.可分4个基因群(I群、Ⅱ群、Ⅲ群和Ⅳ群),为4种基因群分别占7.87%(7/89)、3.37%(3/89)、87.64%(78/89)、1.12%(1/89)。成簇率为4.49%(4/89);近期感染率最小估计为2.25%(2/89)。15个VNTR位点中有4个位点的多态性较好(h0.60),5个位点的多态性尚可(0.3≤h≤0.6),6个位点的多态性较差(h0.3)。结论初步证实陕西省耐药结核分枝杆菌菌株存在明显的基因多态性,其主要流行型为Ⅲ群。     

间隔区寡核苷酸分型技术用于结核分枝杆菌多重感染的初步研究

目的 初步评价间隔区寡核苷酸分型(Spoligotyping)技术在鉴定结核分枝杆菌多重感染中的应用。方法 选取结核分枝杆菌临床分离株,5 μm孔径滤膜过滤法制备单个细菌菌悬液,平板接种37 ℃培养,选取生长良好的单个菌落培养增菌,提取基因组DNA,Spoligotyping进行基因分型鉴定,比较临床分离株与相应的单克隆分离株的分型结果。结果 共选取32株结核分枝杆菌临床分离株,获得306个单克隆分离株。Spoligotyping分型鉴定结果显示30株结核分枝杆菌临床分离株与相应的单克隆分离株的分型结果一致,2株临床分离株的单克隆分离株呈现了多种基因型,多重感染率为6.25%。结论 Spoligotyping可用于快速,有效地区分结核分枝杆菌多重感染。     

结核分枝杆菌T7噬菌体展示基因组DNA文库的构建与鉴定

目的 利用T7噬菌体作为载体,构建结核分枝杆菌的基因组DNA文库。方法 提取MTB的基因组DNA,用EcoR I和Hind III进行双酶切,以对基因组DNA进行片段化,并在其末端加上定向的EcoR I和Hind III黏性末端,用DNA片段纯化分离柱除去小于200 bp的片段和多余接头。将DNA片段与T7 10-3b噬菌体连接,经包装蛋白进行包装后转入BLT5403宿主菌以构建T7噬菌体展示基因组DNA文库,并检测文库的滴度和随机性。结果 成功提取到较高质量的MTB基因组DNA;构建的T7噬菌体展示基因组DNA文库的滴度约为6×10⁶ pfu/cm³;用PCR检测结果表明,在随机挑取的16个噬菌斑中,其重组率为100%,且插入片段都介于250~2 000 bp左右。结论 成功构建了MTB T7噬菌体展示基因组DNA文库,为从基因组范围筛选MTB的优势抗原奠定了前期实验基础。