恒河猴骨髓间充质干细胞分离培养及其生长特性

采用密度梯度离心和贴壁筛选方法分离纯化了恒河猴骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells from bone marrow of Rhesus monkey,RhBMSCs);通过表面抗原检测和核型分析对细胞进行了初步鉴定;通过生长曲线的绘制和细胞凋亡的检测探讨了细胞的生长特点。本实验获得的RhBMSCs形态以梭型为主,核型正常,CD29表达率为99.2%,CD34、CD45、HLA-DR表达率均低于3.2%,RhBMSCs表型符合间充质干细胞的特点,且纯度较高,细胞生长旺盛,但倍增时间有随传代数的增加而逐渐延长的趋势。本实验探讨了RhBMSCs的体外分离、扩增培养及鉴定的方法,并对其生长特点进行了初步观察,这不仅有助于进一步了解与之近似的人的骨髓间充质干细胞的相关特性,而且为以猕猴为对象的BMSC定向分化和组织修复等动物体内实验打下了基础。     

添加特需营养素的营养支持对手术创伤后肠黏膜形态和屏障功能的影响

目的 探讨补充益生菌等特需营养素对手术应激后机体肠道屏障功能、上皮紧密连接及微生态的影响.方法 SD大鼠70只随机分成对照组、全肠外营养组(TPN组)、普通肠内营养组(EN组)和生态免疫肠内营养组(EEN组).建立创伤应激模型,接受等氮、等能量营养支持后光镜和电镜下观察肠黏膜形态和紧密连接,比较肠道细菌脏器易位率、肠道菌群数量及肠黏膜occludin蛋白免疫组织化学表达.结果 (1)电镜下观察,TPN组肠上皮损伤程度较严重,而EN组和EEN损伤程度较轻,肠上皮紧密连接、微绒毛较完整;光镜下chiu分级,TPN组和EN及EEN组比较差异有统计学意义(P<0.05).(2)EEN组和EN组肠道跨膜结合蛋白表达明显优于TPN组,且EEN和EN组间差异也有统计学意义(P<0.05).(3)EEN组和EN组肝、肺和肠系膜淋巴结的肠道细菌易位率低于TPN组,差异有统计学意义(P<0.05).(4)EEN组和EN组肠道内乳酸杆菌和双歧杆菌数量均高于TPN组,差异有统计学意义(P<0.05).结论 联合益生菌、肠道黏膜营养素、免疫营养素的营养支持能明显改善肠道微生态环境,维持肠道黏膜屏障和紧密连接,从而防止肠道菌群易位.     

毛细管胶束电动色谱法测定内江猪血清中的安替比林

研究毛细管胶束电动色谱法（ Ｍ Ｅ Ｋ Ｃ）测定血清安替比林的方法。以对乙酰氨基酚为内标,采用 Ｍ Ｅ Ｋ Ｃ 技术,调节电泳缓冲液 ｐ Ｈ 和表面活性剂 Ｓ Ｄ Ｓ浓度,取得了最佳分离效果。最佳分析条件为５０ ｍ ｍ ｏｌ／ Ｌ硼酸硼酸钠缓冲液（含 ５０ ｍ ｍ ｏｌ／ Ｌ Ｓ Ｄ Ｓ,ｐ Ｈ ９０１）;毛细管内径 ７５ μｍ ,有效长度 ４０ ｃｍ ,毛细管温度 ２０℃,压力进样 １０ ｓ,电压 ２０ ｋ Ｖ,２５４ ｎｍ Ｕ Ｖ 检测。方法快速,电泳 ８ ｍ ｉｎ 即可完成对 Ａ Ｐ和 Ａ Ａ Ｐ 的有效分离和定量。在 ５～３２０ μｇ／ｍ ｌ范围内线性良好（ｒ＝ ０９９９９）。并研究了 Ａ Ｐ 在内江猪体内的药代动力学,血药浓度时间数据经 ３ Ｐ８７ 药动学软件处理得到药代动力学参数,发现内江猪对 Ａ Ｐ 的代谢为二室开放模型,消除半衰期为 ６２３５ ｍ ｉｎ,血浆清除率为 ５２ ｍ ｌ／（ｋｇ·ｍ ｉｎ）。     

猪同种异体肾移植术前组织配型方法探讨

同种异体器官移植及建立器官移植模型术前进行严格组织配型有利于减少免疫学因素的影响,使受体和移植物长期存活。由于目前没有成熟的猪组织配型方法及试剂,我们模拟人器官移植方法选择供受体建立猪同种异体肾移植模型。从23头四川白猪中选择ABO血型相同、ABO血交叉配血反应阴性、微量淋巴细胞毒反应(CDC)、阴性单向混合淋巴反应(MLR)相对较低的同胞猪共6对(1例只作供体)为供受体行单肾原位移植,另一侧肾切除。5例组织相容性较低(MLR在2175～3560之间,CDC计分在1～4分之间),其中2例于术后第2d死于手术打击,2例术后第4d分别死于急性肾小管坏死和加速性排斥反应,1例术后1周死于急性肾小管坏死。6例组织相容性较高(MLR在982～1916之间,CDC计分在2～4分),其中1例死于手术麻醉,3例分别于术后2周死于加速排斥和急性排斥,1例术后肾功能良好,另1例术后发生轻微排斥反应,而后肾功能恢复正常。提示模拟人组织配型方法选择供受体可以建立猪同种异体肾移植模型。通过ABO血型、交叉配血、CDC及MLR实验筛选成功地避免了超急性排斥反应的发生。但从本实验数据中很难分析该配型方案在避免加速型排斥反应、急性排斥反应和慢性排斥的作用,进一步的实验仍在研究之中。     

成骨分化的骨髓间充质干细胞的免疫原性

目的:骨髓间充质干细胞(mesenchymal stemcells,MSC)具有多向分化潜能,又因其低免疫原性,成为细胞移植治疗的良好选择。本实验室前期实验表明猪MSC具有低免疫原性和免疫调节作用,而猪MSC在人体内微环境中,将自动分化。本试验研究猪MSC在体外诱导分化后是否还能维持其低免疫原性,仍具有免疫调节作用。方法:MSC细胞从近交系版纳微型猪骨髓中分离获得,转入SV40基因,进行永生化。再用β-甘油磷酸钠、地塞米松、抗坏血酸磷酸盐等体外诱导其分化为成骨细胞,以未分化MSC为对照,用RT-PCR法检测分化MSC的主要组织相容性抗原(swine lymphocyte antigen classⅠ、classⅡ,SLAⅠ、SLAⅡ)的表达情况,用单向混合淋巴细胞反应(MLR)的方法检测分化MSC是否仍不能引起人外周血淋巴细胞(human peripheral blood lymphocyte,hPBL)的增殖反应。结果:RT-PCR结果显示未分化MSC只有SLAⅠ表达;分化MSC既有SLAⅠ,也有SLAⅡ的表达,但很低。这一结果支持MSC的低免疫原性特性。混培结果也显示分化猪MSC与未分化猪MSC一样都不引...     

免疫抑制剂依维莫司对大鼠胰岛细胞的毒性作用

目的 观察依维莫司等免疫抑制剂对大鼠胰岛瘤细胞(INS-1)和SD大鼠正常胰岛细胞代谢活性和功能的影响,旨在探讨依维莫司在胰岛移植免疫抑制治疗中的安全性和可行性.方法 不同浓度梯度免疫抑制剂依维莫司、西罗莫司、环胞霉素A和霉酚酸酯处理INS-1和正常胰岛细胞,用MTT法检测细胞的代谢活性;用葡萄糖刺激胰岛素分泌实验检测胰岛细胞的胰岛素分泌功能.结果 临床血药浓度以上的依维莫司和西罗莫司高浓度组胰岛细胞增殖抑制率低于环胞霉素A和霉酚酸酯(P＜0.05);依维莫司在临床血药浓度范围和其它免疫抑制剂一样可以抑制胰岛细胞的胰岛素分泌功能,各组间的刺激指数差异无统计学意义.结论 依维莫司和西罗莫司对INS-1细胞及SD大鼠胰岛的毒性作用较小,环胞霉素A和霉酚酸酯对INS-1和SD大鼠胰岛具有较为明显的毒性作用,依维莫司有望作为新型免疫抑制剂应用于临床胰岛移植.     

不同分离及培养方法对大鼠骨髓间充质干细胞生长增殖和生物学特性的影响

目的 探讨获得大量、高纯度、高活性骨髓间充质干细胞(BMSCs)的有效途径.方法 用密度梯度离心法和贴壁法分离纯化BMSCs,在无血清、含小牛或胎牛血清以及不同体积分数的胎牛血清的培养基中培养,传代扩增,观察各组细胞形态、生长特性,测定生长曲线,免疫细胞化学染色鉴定表面抗原,电镜观察细胞显微结构.结果 密度梯度离心法可获得较纯的原代细胞,但细胞增殖缓慢,容易老化;贴壁法分离的细胞生长增殖迅速,经传代换液,第4代细胞基本纯化;小牛和胎牛血清均能促进BMSCs生长增殖,但在体积分数为0.12的胎牛血清中集落形成率最高(46.50%);细胞表达CD44、CD90,而CD14、CD45阴性;电镜下BMSCs符合干细胞的一般特性.结论 经多次换液、严格控制传代消化时间(2～3 min)和酶浓度(2.5 g/L),采用贴壁纯化法在含体积分数为0.12的胎牛血清L-DMEM培养液中培养可获得大量、高纯度、高活性的BMSCs.     

应用胆道化学性栓塞进行化学性肝切除的实验研究

目的　探讨应用胆道化学性栓塞进行化学性肝切除的可行性、疗效和作用机理。方法应用苯酚或无水乙醇与氰基丙烯酸酯对大鼠行胆道化学性栓塞,通过组织学观察、Fas和TGF β1的检测初步探讨化学性肝切除的可行性和作用机理。结果　苯酚与氰基丙烯酸酯的组合能够更好的毁损、栓塞肝内胆道系统,并在栓塞肝叶的周边部取得了无肝细胞存在的化学性肝切除的效果。苯酚栓塞组和乙醇栓塞组的Fas(88 90±38 10 ,72 39±2 9 5 1)和TGF β1表达(185 2 2±70 39,16 3 5 6±5 1 75 ) ,均高于胆管结扎组(2 6 31±12 0 7,74 84±4 0 73) (q值分别为10 37、8 4 5、9 83和8 0 7,P <0 0 5 )。而苯酚栓塞组的羟脯氨酸含量(4 89±0 83mg/g 湿肝重)又高于乙醇栓塞组(3 5 4±0 87mg/g 湿肝重) (q=6 2 5 ,P <0 0 5 )。结论　胆道化学性栓塞有可能达到化学性肝切除的效果。     

同种异体皮质骨板移植免疫学研究

目的: 探讨实验动物和患者接受不同方法处理的同种异体皮质骨板移植后宿主免疫学反应。方法: 48只山羊接受分别经过 -70℃深低温冷冻 4周、 -70℃深低温冷冻 4周 48℃环氧乙烷灭菌、-70℃深低温冷冻 4周 25kGyγ射线辐照处理的同种异体皮质骨板移植,对照组移植异体山羊新鲜皮质骨板。7例髋关节置换术后股骨假体周围骨折患者, 接受深低温冷冻和环氧乙烷处理同种异体皮质骨板移植重建股骨骨折。检测实验动物外周血CD4 、CD8 以及患者外周血T淋巴细胞亚群、抗体、补体和循环免疫复合物。结果: 新鲜骨板移植组CD4 明显升高, 术后 6周达到顶峰。除深低温组术后 6周CD4 升高外, 深低温冷冻、深低温冷冻 环氧乙烷及深低温冷冻 γ射线辐照组T淋巴细胞亚群无明显改变。患者T淋巴细胞亚群、抗体和免疫复合物正常, 切口无感染。结论: 新鲜同种异体皮质骨板具有抗原性, 移植后诱发宿主免疫排斥反应; 深低温冷冻、深冻 环氧乙烷和深冻 γ射线辐照处理同种异体皮质骨板移植受体无明显免疫排斥反应。     

添加特需营养素的营养支持对手术创伤后肠黏膜形态和屏障功能的影响

目的 探讨补充益生菌等特需营养素对手术应激后机体肠道屏障功能、上皮紧密连接及微生态的影响.方法 SD大鼠70只随机分成对照组、全肠外营养组(TPN组)、普通肠内营养组(EN组)和生态免疫肠内营养组(EEN组).建立创伤应激模型,接受等氮、等能量营养支持后光镜和电镜下观察肠黏膜形态和紧密连接,比较肠道细菌脏器易位率、肠道菌群数量及肠黏膜occludin蛋白免疫组织化学表达.结果 (1)电镜下观察,TPN组肠上皮损伤程度较严重,而EN组和EEN损伤程度较轻,肠上皮紧密连接、微绒毛较完整;光镜下chiu分级,TPN组和EN及EEN组比较差异有统计学意义(P<0.05).(2)EEN组和EN组肠道跨膜结合蛋白表达明显优于TPN组,且EEN和EN组间差异也有统计学意义(P<0.05).(3)EEN组和EN组肝、肺和肠系膜淋巴结的肠道细菌易位率低于TPN组,差异有统计学意义(P<0.05).(4)EEN组和EN组肠道内乳酸杆菌和双歧杆菌数量均高于TPN组,差异有统计学意义(P<0.05).结论 联合益生菌、肠道黏膜营养素、免疫营养素的营养支持能明显改善肠道微生态环境,维持肠道黏膜屏障和紧密连接,从而防止肠道菌群易位.